仿生油菜蜂花粉化學成分研究

楊茂森王 鑫張世文劉占莉（甘肅耐克特蜂產品有限公司，天水740；甘肅省養蜂研究所，天水740）

仿生油菜蜂花粉化學成分研究

楊茂森1王 鑫1張世文2劉占莉2
（1甘肅耐克特蜂產品有限公司，天水741022；2甘肅省養蜂研究所，天水741022）

采用柱色譜分離純化技術，從仿生油菜蜂花粉經微波提取后的乙醇提取物中分離純化鑒定出12個化合物。經UV，IR，MS和NMR鑒定為豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitost-erol）、胡蘿卜苷（daucosterol）、十六烷酸（palmitic acid）、癸烷（decane）、亞油酸（linoeic acid）、蘆丁（Rutin）、槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖（2-1）-β-D-葡萄糖苷（kaemferol-3-O-β-D-glucosyl-（2-1）-β-D-glucoside）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（2→1）-β-D-葡萄糖苷/quercetin-3-O-β-D-glucosyl-（2-1）-β-D-glucoside。其中從仿生油菜蜂花粉分離鑒定出的各化合物與從油菜蜂花粉中分離得到的基本相同。

仿生油菜花粉；黃酮；化學成分

油菜（Brassica campestris L）的花粉有一定抗氧及抗良性前列腺增生的藥效［1］。所含化學成分比較復雜，研究表明目前已發現的化合物主要集中在黃酮、甾醇、脂肪酸及其衍生物等幾類主要的物質上［2-5］。為了探究天然油菜花粉與仿生花粉可能的藥效活性成分及差別，本研究將仿生油菜花粉經乙醇微波提取后得到乙醇提取物，取乙醇提取物的石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部位及正丁醇萃取部位，利用多種柱色譜及波譜技術共分離鑒定了豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（βsitosterol）、胡蘿卜苷（daucosterol）、十六烷酸（palmitic acid）、癸烷（decane）、亞油酸（linoeic acid）、蘆丁（Rutin）、槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖（2—1）-β-D-葡萄糖苷（kaemferol-3-O-β-D-glucosyl-（2→1）-β-D-glucoside）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（2→1）-β-D-葡萄糖苷/quercetin-3-O-β-D-glucosyl-（2→1）-β-D-glucoside。其中分離鑒定出的各化合物與從油菜花粉中分離得到的基本相同。

1　儀器與材料

熔點儀：X-4型顯微熔點測定儀（溫度計未校正）；紅外光譜儀：NEXUS 670型傅立葉變換紅外光譜儀（KBr壓片，德國Bruke公司）；紫外光譜儀：UV-2001型紫外光譜儀（日本日立公司）；核磁共振儀：INOVA-400型核磁共振波譜儀（美國Varian公司），TMS為內標物；質譜儀：LCQ Deca XP plus ESI-MS/MS質譜儀，ZHBHS質譜儀EI-MS；柱層析硅膠：200-300目和160-200目，青島海洋化工廠；薄層層析硅膠：H60、GF254，青島海洋化工廠；顯色劑：20%的硫酸乙醇溶液，碘蒸氣；試劑：工業試劑重蒸。

油菜Brassica campestris L．花粉由甘肅耐克特蜂產品有限公司采集，并通過蘭州大學藥學院馬志剛教授鑒定。

仿生油菜蜂花粉的制備：油菜蜂花粉精選除雜，經臭氧殺菌滅菌后，按蜂花粉重量的15～30%噴灑生理鹽水，攪拌均勻后在溫度為28～38℃條件下培養48～50 h，完成脫敏處理。再按每份1 kg均勻噴灑200～300 ml蜂巢花粉培養液，在溫度為28～35℃條件下培養48～50 h，再按每份1 kg均勻噴灑200～300 ml酵母菌液，在溫度為28～35℃條件下培養48～50 h，按每千克均勻噴灑200～300 ml乳酸菌液，在溫度為28～35℃條件下培養60～72 h，完成生物發酵。用60目的紗網制成小顆粒后，進行真空度為-0.009 MPa，溫度-55～-65℃真空凍干，使花粉中含水量在3～5%即可。并置于臭氧滅菌罐中滅菌50分鐘，即制備出凍干活性仿生蜂花粉。

2　方法與結果

2．1提取分離

將仿生油菜蜂花粉2.5 kg以70%乙醇滲漉提取，減壓濃縮，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各萃取多次，減壓蒸干，取其中所得石油醚萃取物（78 g）、乙酸乙酯萃取物（100.04 g）和正丁醇萃取物（186.01 g）繼續試驗。將石油醚萃取物上硅膠柱，依次以石油醚（100%～0%）∶乙酸乙酯（0%～100%）梯度沖柱，得流份la～8a。流份2a上硅膠柱除雜，經制備薄層色譜［展開劑：石油醚∶乙酸乙酯（3∶2）］得化合物1（120 mg），流份4a上硅膠柱除雜，經制備薄層色譜［展開劑：石油醚∶乙酸乙酯（1∶1）］得化合物2（60 mg），流份5a上硅膠柱除雜，經制備薄層色譜［展開劑：石油醚∶乙酸乙酯（3∶7）］得化合物3（30 mg），流份7a上硅膠柱除雜，經制備薄層色譜［展開劑：石油醚∶乙酸乙酯（1∶3）］得化合物4（120 mg），流份8a上硅膠柱除雜，經制備薄層色譜［展開劑：石油醚∶乙酸乙酯（1∶8）］得化合物5（34 mg）。

將乙酸乙酯萃取物上硅膠柱，依次以乙酸乙酯及10%、30%、50%、70%、100%甲醇梯度洗脫，得不同濃度甲醇洗脫組分。用甲醇洗脫，得流份lb～6b。流份2b上硅膠柱除雜，經制備薄層色譜［展開劑：氯仿∶乙酸乙酯（3∶2）］得化合物6（70 mg）；流份3b經制備薄層色譜［展開劑：氯仿∶甲醇（1∶1）］得化合物7（87 mg）；流份4b經制備薄層色譜［展開劑：氯仿∶甲醇（15∶1）］得化合物8（73 mg）；流份5b經制備薄層色譜［展開劑：石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇（2∶1∶2）］得化合物8（60 mg）。

將正丁醇萃取物按上法操作，得不同濃度甲醇洗脫組分。將50%甲醇洗脫組分上硅膠柱，用甲醇-水洗脫，按份收集，合并得流份1c～5c，流份1c經制備薄層色譜［展開劑：氯仿∶甲醇（1∶1）］及制備型液相色譜（40%甲醇洗脫）制得化合物9（23 mg）；流份2c經制備薄層色譜［展開劑：氯仿∶甲醇（2∶1）］及制備型液相色譜（50%甲醇洗脫）得化合物10（19 mg），經制備薄層色譜［展開劑：氯仿∶甲醇（4∶1）］得化合物11（123 mg）。將70%甲醇洗脫組分上硅膠柱色譜，以氯仿∶甲醇（12∶1）洗脫，得化合物12（82 mg）及流份1d～4d，流份1d經制備薄層色譜［展開劑：氯仿∶甲醇（10∶1）］得化合物13（22 mg），流份3d經制備薄層色譜［展開劑：氯仿∶甲醇（5∶1）］及制備型液相色譜（45%甲醇洗脫）得化合物14（32 mg）。

2.2結構鑒定

化合物1：無色片狀晶體（石油醚-乙酸乙酯），m.p.：147～149℃，H2SO4顯紫紅色。紅外光譜IR（KBr）cm-1：3400.2（-OH），2950.6，1641.7，1375.5，1063.3，812.2。EIMS m/z：412［M］+，394［M+-H2O］，253，229，171，157。其IR，MS，1H-NMR譜與豆甾醇文獻［6-7］一致，與對照品混合熔點不下降，化合物1被鑒定為豆甾醇（stigmasterol）。

化合物2：無色針狀晶體（石油醚-乙酸乙酯），m.p.：138～140℃，TLC遇H2SO4乙醇顯紫紅色。紅外光譜IR （KBr）cm-1：3419.1（-OH），2951.5，2920.3，1070.1，802.2。EI-MSm/z：414［M］+，396［M-H2O］+，314，255，231，213，159，107。其中IR，MS，1H NMR，13C NMR譜與β-谷甾醇文獻［7］一致，TLC做對照，Rf值及色斑相同，并與對照品混合熔點不下降，化合物2被鑒定為β-谷甾醇 （β-sitosterol）。

化合物3：白色顆粒狀（甲醇），m.p.：288～290℃，H2SO4顯紫紅色。紅外光譜IR（KBr）cm-1：3410.6（-OH），2938.6，2875.4，1630.2，1460.1，1375.3，1071.2，1024.1，800.3。FAB-MS m/z：576［M］+，414［M+-Glc］。13C-NMR（DMSO-d6）δppm：37.3，29.7，77.4，40.5，140.9，121.6，31.8，31.9，50.1，36.7，21.1，38.8，42.3，56.6，24.3，28.3，55.9，12.1，19.6，35.9，19. 1，33.8，25.9，45.6，29.2，19.4，20.2，23.1，12.3，101.3，70.6，77.2，73.9，77.3，61.6。其IR，MS，1H NMR，13C NMR譜與胡蘿卜苷（daucosterol）文獻一致；化合物3 50 mg，溶于50 ml 50%甲醇，加入適量鹽酸，水浴回流至水解完全。過濾，苷元鑒定為β-谷甾醇（β-sitosterol）；水溶液濃縮后作紙層析檢查，與D-glucopyranose TLC做對照，Rf值及色斑相同，化合物3與對照品混合，熔點不下降，化合物3被鑒定為胡蘿卜苷（daucosterol）。

化合物4：白色鱗片狀固體（氯仿-甲醇），m.p.：63～64℃，紅外光譜IR（KBr）cm-1：3038.6（締合 OH），2916.7，2851.6，1706.7（C=O），1463.4，1299.7，940.4。EIMS m/z：256［M］+，227，211，60，45；1H NMR（CDCl3）δppm：5.12（1H，s，OH），2.33（2H，d，J=7.6Hz，CH2-COOH），1.62（2H，m，J=7.2Hz，CH2），1.29（24H，m，12×CH2），0.85（3H，m，CH3）。13C NMR（CDCl3）譜有一羰基碳δ179.6，其它碳化學位移分別為：34.0，31.9，29.7，29.6，29.6，29.4，29.3，29.2，29.0，24.7，22.6，14.0。其 IR，1HNMR，13C NMR數據與十六烷酸的文獻值［8］一致。化合物4被鑒定為十六烷酸（palmitic acid）。

化合物5：白色鱗片狀固體或無色液體（氯仿-甲醇），紅外光譜IR（KBr）cm-1：2954.5，2923.6，2854.2，1463.0，1377.7，728.6，720.8。1HNMR（CDCl3）δppm：0.88 （6H，t，2×CH3），1.25（16H，s，8×CH2）。13C NMR（CDCl3）δ14.1，22.7，29.3，29.6，29.7，31.9。其IR，1HNMR，13C NMR數據與癸烷（decane）的文獻值［8］一致。化合物5被鑒定為癸烷（decane）。

化合物6：棕黃色的油狀液體，紅外光譜IR（KBr）cm-1：3418.8，3010.6，2906.3，2856.3，1710.3（C=O），1466.4，1377.2，1179.9，1035.6，723.4。EI-MS m/z：280［M］+；1H NMR（CDCl3）δppm：5.34（1H，dd，-CH=CH），2.31（2H，dd，-CH2COOH），2.03（2H，m，-CH2），1.66（3H，t，CH3）。13C NMR （CDCl3）δppm：179.2，34.0，24.7，29.0，29.0，31.8，29.7，27.1，127.9，129.9，25.5，129.6，127.8，27.1，29.2，31.4，22.6，14.0。其IR，1HNMR，13C NMR數據與亞油酸（linoeic acid）的文獻值［10］一致。化合物6被鑒定為亞油酸（linoeic acid）。

化合物7：淡黃色粉末，測得m.p.：176～178℃，UV-vis（MeOH，λmax）257，358nm；LC-MS（ESI+），［MC5H8O4-OH-Glc］+at m/z297.8，1H-NMR（400 MHz，DMSO6），δ6.21（d，1H，J=2Hz，C6-H），6.40（d，1H，J=2Hz，C8-H），7.55（d，1H，J=2.1Hz，C2′-H），6.86（d，1H，J=9Hz，C5′-H），7.56（dd，1H，J=9，2.1，C6′-H），9.71（s，1H，C4′-OH），9.21（s，1H，C3′-OH），12.62（s，1H，C5-OH），10.86（s，1H，C7-OH），5.35（d，1H，J=7.4Hz，H1-G），5.12（（d，1H，J= 1.9Hz，H1-R），1.00 （d，3H，J=6.1，CH3-R）；13C-NMR （100MHz，DMSO6）δ156.90（C2），133.80（C3），177.85（C4），157.07（C5），99.13（C6），164.52（C7），94.04（C8），161.70（C9），104.46（C10），122.06（C1′），115.70（C5′），145.22（C3′），148.87 （C4′），116.75（C5′），121.67（C6′），101.20（C1-G），74.55（C2-G），76.95（C3-G），72.34（C4-G），76.40（C5-G），67.47（C6-G），101.67（C1-R），70.49（C2-R），70.84（C3-R），71.05（C4-R），68.69（C5-R），18.18（C6-R）［R and G represent signals from rhamnose and glucose moieties，respectively］。其 UV，1HNMR，13C NMR，MS數據與蘆丁的文獻值［8］一致。化合物7被鑒定為蘆丁（Rutin）。

化合物8：黃色晶體（乙酸乙酯），m.p.：310～312℃，LC遇硫酸乙醇顯黃色IR（KBr）：3462，3375，3292，3080，1672，1614，1549，1551，1462cm-1，1H-NMR（400MHz，CDCl3），δ：12.47（1H，s，OH-8），10.76（1H，s，OH-8），9.57（1H，s，OH-3），9.35（1H，s，OH-3），9.29（1H，s，OH-4），7.66（1H，d，J=2.2Hz，H-2），7.52（1H，d，J=2.2Hz，H-6），6.85（1H，d，J=8.8Hz，H-5），6.39（1H，d，J=2.2Hz，H-8），6.18（1H，d，J=2.0Hz，H-6）；13C-NMR（100MHz，CDCl3）δ：147.3，136.6，176.3，161.7，99.0，165.1，94.4，157.9，104. 5，123.5，115.5，145.8，116.0，121.3。IR，1H-NMR，13CNMR光譜數據與文獻值［8］一致，故化合物8被鑒定為槲皮素（quercetin）。

化合物9：淡黃色顆粒晶體（乙酸乙酯），m.p.：246～248℃，TLC遇硫酸乙醇顯黃色。IR（KBr）cm-1ν：3459，3372，3287，3075，1668，1609，1543，1547。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：6.17（IH，d，J=2.0 Hz，H-6），6.42（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），為A環質子信號，其偶合常數表明為間位偶合；δ 6.65（IH，SH-3）是典型的黃酮3位質子吸收峰δ7.37（IH，d，J=2.0Hz，H-2），6.87（IH，d，J=8.4 Hz，H-5），7.39 （IH，d，J=2.0 Hz，H-6）為B環質子信號，其偶合常數表明B環為1，3，4一三取代形式。其波譜數據與文獻［11］報道的木樨草素的基本一致，故化合物9被鑒定為木樨草（luteolin）。

化合物10：黃色粉末，25%硫酸乙醇顯亮黃色，m. p.：280～282℃。ESI-MS（m/z）：285.1［M-H］+。1H-NMR （400 MHz，CD3OD）δ：6.21（1H，d，J=1.6 Hz，H-6），6.44 （1H，br s，H-8），6.92（2H，d，J=8.0 Hz，H-3'，H-5'），8.23 （2H，d，J=7.6 Hz，H-2'，H-6'）。以上數據結合文獻［8］，故化合物10被鑒定為山奈酚。

化合物11：黃色粉末，25%硫酸乙醇顯亮黃色，m. p.：222～224℃。ESI-MS（m/z）：633.0［M+Na］+，609.2［MH］+。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：8.0 1（2H，d，J=8.34 Hz，H-2'，H-6'），6.93（2H，d，J=8.34 Hz，H-3'，H-5'），6.44（1H，br s，H-8），6.23（1H，br s，H-6），5.21（1H，d，J= 7.12 Hz，H-l''），4.76（1H，d，J=7.22 Hz，H-1'''）；13C-NMR （100 MHz，CD3OD）δ：158.65（C-2），135.02（C-3），179.65 （C-4），161.63（C-5），100.23（C-6），166.23（C-7），94.93（C-8），158.66（C-9），105.78（C-10），122.67（C-1'），13243（C-2'，6'），116.46（C-3'，5'），159.54（C-4'），94.93（C-1''），82.91 （C-2''），77.74（C-3''），71.68（C-4''），78.13（C-5''），62.56 （C-6''），105.41（C-1'''），75.77（C-2'''），77.78（C-3'''），71.23（C-4'''），78.56（C-5'''），62.34（C-6'''）。以上數據與文獻［12］報道的化合物山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖（2—1）-β-D-葡萄糖苷數據一致。

化合物12：黃色粉末，25%硫酸乙醇顯亮黃色，（+）ESI-MS m/z 649［M+Na］+，（-）ESI-MS m/z 625［M-H］-。從1H-NMR譜中顯示共有5個芳香質子，其中1對間位偶合質子66.47（1H，s，H-8），6.23（1H，s，H-6），I組ABX偶合系統 δ7.61（1H，d，J=8.45 Hz，H-6'），7.56（1H，s，H-2，），6.86（1H，d，J=8.45 Hz，H-5'），C環質子信號消失，結合13C-NMR譜（δ 133.12，C-3）可知3位被氧取代，以上表明分子中存在槲皮素黃酮母核。1H-NMR譜中還顯示2個糖端質子信號：δ 5.69（1H，d，J=7.45 Hz，H-1''），4.62（1H，d，J=7.45 Hz，H-1''）。13C-NMR顯示含有27個碳信號，其中2個葡萄糖原子信號103.93（C-1''），98.10（C-1''），82.73（C-2''），77.65（C-3'''，C-5'''），76.76（C-5''），76.65（C-3''），74.54（C-2'''），69.45（C-4''，4'''），60.67（C-6''），60.76（C-6''），再根據糖端基氫的偶合常數可確定2個葡萄糖都為β型。化合物12的1HNMR和13C-NMR數據與文獻［13］報道的數據基本一致，故可確定化合物12為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖（2—1）-β-D-葡萄糖苷。

3結語

本研究運用多種柱色譜技術對仿生油菜花粉的化學成分作了初步研究，共分離鑒定了14種化合物，鑒定了12種化合物，包括6種黃酮、兩種脂肪酸類物質、3種萜類及一個烷烴。其中仿生油菜花粉分離鑒定出的各化合物與從油菜花粉中分離得到的基本相同。鑒于黃酮及不飽和脂肪酸類物質都是重要的活性成分，這些化合物不僅豐富了仿生油菜花粉的化學成分研究，還提示探尋仿生油菜花粉中的藥效物質可圍繞這兩類物質展開而研發。

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Study on Chemical Constituents of Pollen of the Bionic Brassica campestris L

Yang Maosen1，Wang Xin1，Zhang Shiwen2，Liu Zhanli2
（1 Gansu Nectar Bee product Co.，Ltd，Tianshui 741022，Gansu；2 Gansu Apicultural Research Institute，Tianshui 741022，Gansu）

Column chromatography were used for the isolation and purification of the chemical constituents of ethanol extract of the pollen of the bionic Brassica campestris L.after extraction by microwave．Twelve compounds were identified by means of UV，IR，MS and NMR spectroscopy as：stigmasterol，β-sitosterol，daucosterol，palmitic acid，decane，linoeic acid，Rutin，quercetin，luteolin，kaempferol，kaemferol-3-O-β-D-glucosyl-（2-1）-β-D-glucoside，quercetin-3-O-β-D-glucosyl-（2-1）-β-D-glucoside．

Brassica campestris L；pollen；flavonoid；chemical constituents