特發性肺纖維化病人血清中SPA的表達及其臨床應用價值

宋　磊　李　丹　竭　晶　趙　丹　華樹成　彭麗萍

(吉林大學白求恩第一醫院呼吸科，吉林　長春　130021)

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特發性肺纖維化病人血清中SPA的表達及其臨床應用價值

宋磊李丹竭晶趙丹華樹成彭麗萍

(吉林大學白求恩第一醫院呼吸科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討肺表面活性蛋白A(SPA)在特發性肺纖維化(IPF)患者外周血漿中的水平及其對臨床診斷的指導意義。方法收集18例IPF患者、22例特發性非特異性間質性肺炎(I-NSIP)患者和28例健康對照者的外周血漿，通過比較蛋白質學篩選出差異表達的蛋白質譜，并通過酶聯免疫吸附(ELISA)法驗證血漿該蛋白質譜的表達。結果與I-NSIP患者以及健康對照者相比，IPF患者外周血漿中SPA表達水平明顯升高(P<0.01)，而I-NSIP患者與頭痛患者SPA水平無明顯差異(P>0.05)。血漿濃度為40.85 ng/ml可作為鑒別診斷IPF和I-NSIP的cut-off值，其敏感性和特異性分別為66.7%和86.4%。結論SPA在IPF患者外周血漿中表達上調，并且血漿SPA可作為IPF診斷的生物學標志物。

〔關鍵詞〕特發性肺間質纖維化；特發性非特異性間質性肺炎；蛋白質組學

第一作者：宋磊(1984-)，男，主治醫師，博士，主要從事呼吸疾病免疫學研究。

特發性肺間質纖維化(IPF)是一種彌漫性間質性肺病(ILD)，診斷后中位生存期3～5年〔1〕。因其病因不明，診斷困難，無可靠有效的治療及較差的預后而備受全世界研究者的關注。特發性非特異性間質性肺炎(I-NSIP)是對激素反應較好的一種原發性間質性肺炎，預后好于IPF。然而，IPF與I-NSIP的鑒別尤其困難。本課題組擬研究IPF和I-NSIP患者血漿中差異表達的蛋白，以期發現一組可供兩種疾病鑒別診斷的生物標志物。

1資料與方法

1.1研究對象收集2010年3月至2015年3月我院呼吸科的患者68例，年齡45～75歲，男女不限。IPF組18例，平均年齡51歲，男10例，女8例，吸煙人數占32%，FVC%為56%，DLCO占47%；納入標準：無外科肺活檢者：高分辨率CT表現為普通型間質性肺炎(UIP)，對疑診IPF、CT表現為可能普通型間質性肺炎型和不符合UIP的患者需要外科肺活檢進行病理診斷，結合患者的CT和病理學表現，進行多學科討論，最后診斷IPF。I-NSIP組22例，平均年齡53歲，男14例，女8例，吸煙占27%，FVC%為63%，DLCO占54%，納入標準：高分辨率CT(HRCT)表現與NSIP一致，不符合其他疾病如UIP或慢性過敏性肺炎表現，和(或)肺活檢顯示NSIP病理類型。健康對照者為我院參加正常體檢的45～75歲成人群體中募集。健康成人定義為沒有任何呼吸系統疾病的診斷，沒有其他疾病診斷，過去4 w沒有應用抗生素或無急性呼吸道感染癥狀。HC組共28例，平均年齡49歲，男16例，女12例，吸煙人數占30%，FVC%為103%，DLCO占98%。

1.2主要試劑和儀器肺表面活性蛋白A(SPA)ELISA試劑盒(Abcam，美國)，酶標儀(Bio-Tek，美國)，質譜儀(Ettan MALDI-Tof/Pro，美國)。

1.3檢測方法

1.3.1蛋白質組學檢測首先選擇IPF患者和I-NSIP患者各10例的血漿標本，去除12種血液含量最豐富的蛋白質。處理后的樣本繼而進行差異凝膠電泳(DIGE)。采用DeCyder二維軟件6.5版進行圖像分析，找出兩組間差異表達的蛋白質斑點，差異表達超過1.5倍的蛋白可選擇進行下一步研究。選擇差異表達排在前50位的50種蛋白作為標志物分析。使用質譜儀對50個蛋白斑點進行質譜鑒定。

1.3.2ELISA檢測采集靜脈血5 ml，不抗凝，800 r/min離心10 min后取血漿。并留取患者血漿3 ml用于常規生化檢測，1 ml離心后取上清液分裝儲存于-80℃冰箱中保存。測定時將樣品放于冰上解凍，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。在450 nm處測各樣品的OD值，根據標準品繪制的標準曲線方計算各樣品的濃度。

1.4統計學方法采用SPSS15.0軟件進行t檢驗、方差分析和ROC曲線分析。

2結果

2.1血漿差異蛋白質譜通過DIGE共發現差異表達超過1.5倍的蛋白132種，對差異表達排在前50位的50種蛋白進行質譜鑒定。排除某些蛋白為同一個蛋白的不同異構體或單體，最終鑒定得到的蛋白為32個，包括SPA。其他鑒定出的蛋白還有SPD和八肽膽囊收縮素(CCK-8)等。本研究將采用在IPF和I-NSIP患者中表達差異最顯著的SPA作為對象進一步加以研究。見圖1。

左、右圖分別為IPF患者和I-NSIP患者外周血中蛋白電泳圖，箭頭所示即為兩者表達差異的蛋白SPA圖1　血漿蛋白電泳圖

2.2血漿和血漿中SPA的表達通過ELISA法檢測可知，IPF組患者血漿中SPA的含量為(46.16 ± 2.77)ng/ml，而I-NSIP患者和健康對照血漿中的SPA的含量分別為(33.99 ± 1.55)ng/ml和(31.23 ± 1.34)ng/ml，IPF組患者血漿中SPA水平要明顯高于后兩者(P<0.05)。

2.3SPA對IPF的診斷價值血漿SPA可作為IPF和I-NSIP鑒別診斷的血漿生物學標志物，其最佳診斷切點值(cut-off)為40.85 ng/ml(AUC=0.867，P<0.01)，此值在診斷IPF時的敏感性和特異性分別為66.7%和86.4%。見圖2。

圖2　血漿SPA水平診斷價值的ROC曲線

3討論

IPF組織病理學和放射學表現為UIP〔2〕。目前，IPF的實驗室診斷手段主要依賴于HRCT與肺活檢，但其他類型的間質性肺疾病患者在臨床癥狀、體征及CT影像描述上經常表現出與IPF很大的相似性。因此，臨床上需要更精確的實驗將IPF患者從其他ILD患者中篩選出來，以預測初診ILD患者對治療的反應和預后，指導盡早選擇合適的治療方案。

近年來，蛋白質組學飛速發展，越來越多的研究開始關注多肽組質譜圖特征性的變化作為不同疾病變化指示劑在醫療方面的潛在應用。在人血漿多肽組中含有約5 000個獨特的肽段，尋找和發現有價值的生物標志物已經成為目前醫學研究的一個重要熱點。多學科領域研究證實，比較蛋白質組學是獲取疾病新信息的重要手段，尤其是對于病因及發病機制不明確、疾病進展不可預測的疾病。到目前為止，已發表的相關文章涉及冠心病領域，神經系統疾病及腎臟疾病等。在間質性肺疾病研究領域，一些研究已經應用該方法在IPF患者和正常對照人群的肺泡灌洗液中或IPF患者和結節病患者、系統性硬化癥相關的肺間質纖維化的肺泡灌洗液中鑒定出有診斷意義的生物標志物〔3〕。但目前尚無針對IPF和I-NSIP的比較蛋白質組學研究。肺表面活性物質(PS)是由Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌的一種脂蛋白復合體，主要成分為二棕桐肽卵磷脂和一些特異性蛋白質，主要功能是降低肺泡表面張力并維持肺泡更新和內穩態〔4〕。表面活性蛋白(SP)是PS重要組成成分，包括SPA、SPB、SPC和SPD共4種，其中SPA含量最為豐富，約占SP總量的50%〔4〕。SPA具有局部防御、調節免疫和炎性反應以及促進肺泡代謝、穩定PS的作用〔5〕。在生理情況下，正常人肺泡-毛細血管屏障完好，可以阻止SPA進入血液循環，血漿中SPA水平很低。但在某些病理情況下，由于肺泡-毛細血管屏障的破壞，外周血中SPA可出現異常增多，并與多種肺部疾病的臨床情況密切相關〔6〕。本研究發現IPF患者血漿中SPA水平上調?？紤]上述現象出現的原因可能是由于在IPF患者中Ⅱ型肺泡上皮發生不可逆的大量損壞，細胞中的SPA釋放入血所致。

到目前為止，已有的研究多從已知的病理生理改變及可能的發病機制入手，采用ELISA或免疫組化等方法對預想的蛋白做特異性檢測，雖然樣本規模有限，并缺少可重復性，但都表現出對IPF發生或其結果的判斷意義，這些研究發現的生物標志物包括外周血中的蛋白，如KL-6，SP-A、SP-D，MMP-1、7，CCK-18，YKL-40，S100A9等〔7〕。

綜上，本研究結果不僅提示新型生物學標志物在IPF診斷應用中的潛在價值，還有可能為新型藥物的研發提供基礎。

4參考文獻

1Kim HJ，Perlman D，Tomic R.Natural history of idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.Respir Med，2015；109(6)：661-70.

2Prasad R，Gupta N，Singh A，etal.Diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis：current issues〔J〕.Intractable Rare Dis Res，2015；4(2)：65-9.

3Hara A，Sakamoto N，Ishimatsu Y，etal.S100A9 in BALF is a candidate biomarker of idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.Respir Med，2012；106(4)：571-80.

4Whitsett JA，Wert SE，Weaver TE.Diseases of pulmonary surfactant homeostasis〔J〕.Ann Rev Pathol，2015；10(4)：371-93.

5Awasthi S.Surfactant protein (SP)-A and SP-D as antimicrobial and immunotherapeutic agents〔J〕.Recent Pat Antiinfect Drug Discov，2010；5(2)：115-23.

6Iwamoto H，Gao J，Koskela J，etal.Differences in plasma and sputum biomarkers between COPD and COPD-asthma overlap〔J〕.Eur Respir J，2014；43(2)：421-9.

7Ley B，Brown KK，Collard HR.Molecular biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014；307(9)：L681-91.

〔2015-06-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：彭麗萍(1964-)，女，教授，主任醫師，博士生導師，主要從事慢性阻塞性肺疾病的發病機制研究。

基金項目：吉林省科技廳科研基金資助(No.20130206103SF)

〔中圖分類號〕R563.9

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6465-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.071