血美安對特發性血小板減少性紫癜小鼠免疫細胞因子的調節作用

朱飛躍　王　華

(婁底市中心醫院血液內科,湖南　婁底　417000)

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血美安對特發性血小板減少性紫癜小鼠免疫細胞因子的調節作用

朱飛躍王華1

(婁底市中心醫院血液內科,湖南婁底417000)

〔摘要〕目的通過建立特發性血小板減少性紫癜(ITP)小鼠動物模型，觀察血美安對ITP小鼠外周血細胞因子的影響，探討血美安的免疫調節機制。方法40只Balb/c小鼠隨機分為陰性對照組(A組)、模型組(B組)、陽性對照組(C組)、血美安(D組)組。除A組外，其余各組隔日注射豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)建立ITP小鼠模型。注射GP-APS 6 d后，A組和B組灌服0.9%氯化鈉溶液，C組醋酸潑尼松按5 mg/kg灌胃，血美安膠囊按含藥量為49.1 g/L灌胃。觀察小鼠一般情況，連續給藥14 d后處死小鼠;分離血清檢測血小板、干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素(IL)-4水平。結果與A組比較，IFN-γ水平顯著升高(P<0.05);血小板和IL-4水平顯著下降(P<0.05)，IFN-γ/IL-4比值升高。與B組比較，D組IFN-γ水顯著下降(P<0.05);血小板和IL-4水平顯著升高(P<0.05)，IFN-γ/IL-4比值降低具有顯著差異(P<0.05)。結論血美安可通過影響Th1/Tp細胞因子水平而對ITP免疫功能起到調節作用。

〔關鍵詞〕血美安;特發性血小板減少性紫癜;血小板;干擾素-γ;白細胞介素-4

1中南大學湘雅醫院眼科

第一作者：朱飛躍(1970-),女,副主任醫師,主要從事血小板減少性紫癜的中藥治療研究。

特發性血小板減少性紫癜(ITP)是一種獲得性的自身免疫性疾病，其特點為無明顯外源性病因引起的血小板數目減少和皮膚黏膜的出血，是臨床最為常見的出血性疾病，其發病與T細胞的異常激活、T細胞亞群及其功能改變等有關〔1〕。ITP是一種血小板在體內被破壞導致出血的自身免疫性疾病，免疫異常已構成了發病機制的核心。已有研究表明Th1/Tp的比例增高與ITP的發病和疾病狀態密切相關，并且呈明顯Th1優勢反應〔2〕，臨床研究表明血美安膠囊對 ITP 治療床應用效果理想且無明顯毒副作用〔3〕，但其對免疫功能調節作用機制尚不清楚，本實驗擬通過建立與ITP動物模型，并以血美安進行干預治療，檢測ITP小鼠血清細胞因子干擾素(IFN)-γ和白細胞介素(IL)-4的水平，探討該藥物治療ITP的免疫調節作用機制。

1材料與方法

1.1模型制備本動物實驗使用二級Balb/c小鼠，體重18～22 g，8周齡，共60只，雌雄各半(由南華大學動物實驗中心提供)。 40只小鼠按隨機數字表法隨機分為陰性對照組 (A 組)10 只、 模型組 (B 組)10只、潑尼松陽性對照組(C 組)10只、血美安組(D 組)10只。 造模參考文獻〔4～6〕制作實驗性ITP動物模型，即用豚鼠抗Balb/c小鼠血小板血清(APS)給Balb/c小鼠尾靜脈注射，于造模第1，3，5，7，9，11，13天給小鼠尾靜脈注射 APS 20 μl/20 g，造成小鼠外周血小板持續減少(相當于正常值25%)即為成功模型。

1.2干預方法A 組：正常飼養，并予等量生理鹽水灌胃(四川科倫藥業股份有限公司生產，批準文號：國藥準字B040503-02)。B 組：以上述等量生理鹽水灌胃。C 組：予潑尼松0.5 mg/ml灌胃(浙江仙琚制藥有限公司生產，批準文號：國藥準字p3021207)。D 組：以血美安膠囊灌胃(珠海安生鳳凰制藥有限公司 生產，批號：國藥準字Z20050633)，將膠囊中的顆粒粉末以生理鹽水配成混懸液，含藥量為49.1 g/L灌胃。 除正常組外，其余 3 組小鼠均按上述方法造模，并于造模第6日起均按 0.2 ml/10 g 體質量灌胃，每日 1 次，連續 9 d。

1.3觀察指標為觀察、監測整個實驗過程中小鼠模型一般情況，是否能維持理想狀態，在實驗過程中先后以尾靜脈采血法以檢測對比小鼠血小板(PLT)計數情況。各組小鼠于造模第 15 日處死取材。 觀察一般情況，不良反應，死亡情況，血小板計數變化，故最終實驗結束時，各組取材小鼠數分別為A組10只，B組8只，C組9只，D 組10 只。取小鼠外周血，ELISA方法檢測血清IFN-γ和 IL-4。96孔板分別加入標準品、樣品稀釋液和待測樣品100 μl，37℃ 60 min，洗板5次，甩干;加生物素化的抗小鼠IFN-γ、IL-4 抗體100 μl，37℃ 60 min，洗板同前;加HRP標記的親和素100 μl，37℃ 30 min，洗板同前;加底物工作液(TMB)100 μl，37℃避光15 min，加終止液100 μl，用酶標儀在450 nm處測吸光值(OD值)。繪制標準曲線，所有樣品孔OD值均減除空白孔值后計算IFN-γ和IL-4含量。

1.4統計學方法應用 SPSS16.0 軟件行t檢驗及方差分析。

2結果

2.1各組小鼠一般情況觀察 A組小鼠反應靈活，毛色光潤，喜活動，主動覓食，大便呈條狀。B 組小鼠在造模后的第 5 日即出現軟便，伴有活動減少、喜扎堆、拱背、豎毛、毛不光潔等現象。 注射APS 后 24 h，除 A 組外，其余各組小鼠均出現明顯的皮下紫癜，可見到四肢、腹部、尾部有不同程度出血點和瘀斑。造模第 4 至 5 日出血點和瘀斑最為明顯。在造模第 14 日，與 B 組比較，C、D給藥組小鼠皮下紫癜都有不同程度減輕，其減輕程度各組基本相似。B 組及 C 組各有 12只和 21只小鼠在灌胃時出現死亡，尸解見肺部有挫裂傷，氣管內殘留灌胃藥液，考慮死亡原因為灌胃時灌胃器誤插入氣管，導致小鼠窒息及肺部受損所致。

2.2血美安對ITP模型小鼠外周血血小板數量、細胞因子的影響與A組比較，B組IFN-γ水平升高，IFN-γ/IL-4比值明顯升高，外周血血小板數量和IL-4水平下降(P<0.01)。與B組比較，A組和D組均能降低ITP小鼠血清IFN-γ水平，顯著提升外周血血小板數量和IL-4水平，從而顯著減低IFN-γ/IL-4比值(P<0.05)。見表1。

表1　血美安膠囊對ITP模型小鼠外周血血小板計數、

與A組比較：1)P<0.01；與B組比較：2)P<0.05

3討論

ITP是一種獲得性的自身免疫性疾病，它是一種由血小板自身抗體所致的血小板減少性疾病，常反復發作，其特點為無明顯外源性病因引起的血小板數目減少和皮膚黏膜的出血，是臨床最為常見的出血性疾病〔7〕，其發病與T細胞的異常激活、T細胞亞群及其功能改變等有關。慢性原發性血小板減少性紫癜(CITP)病程較長，大多在1年以上，治療棘手。另外，病人多反復使用腎上腺糖皮質激素治療，長期應用激素治療無效，停用激素后副作用多〔8，9〕。近年來，中醫對于血小板減少性紫癜的治療取得了一定的成就，由豬蹄甲、地黃、赤芍、牡丹皮3種成分組合的血美安膠囊用于血熱傷陰夾瘀所致皮膚紫癜、赤衄、鼻衄、婦女月經過多、口渴、煩熱、盜汗等ITP。但是，此藥物藥理機制研究仍然存在著一些問題：①缺乏公認的、統一的 診斷及療效標準。有的醫家也未將急性型與慢性型區分開來，從而造成療效分析缺乏客觀性、公正性〔10，11〕；②該病除了活血化淤法在臨床和實驗方面研究較深入外，其對ITP免疫功能從實驗角度研究其作用機制較少。本研究通過連續小鼠腹腔注射抗小鼠血小板抗體，使小鼠體內血小板持續處于低水平，成功建立ITP模型。此種方法建立的模型不損害其他臟器特性又符合其發病的原因〔12〕，其臨床表現與ITP基本一致，便于直接觀察藥物的治療效果。本研究證實，血美安可能主要通過減低IFN-γ和提高IL-4水平影響Th1/Tp比值，調節ITP產生的細胞免疫功能紊亂，從而升高外周血血小板數量。

4參考文獻

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4葛衛紅，郭建友，石森林，等．血康口服液對小鼠血小板減少性紫癜模型的作用機理探討〔J〕.中國實驗方荊學雜志,2007;13(3)：47．

5王纓，朱建軍．加味小柴胡對小鼠免疫性血小板減少性紫癜下丘腦-垂體-腎上腺系統的影響〔J〕.北京中醫藥大學學報，2008;31(8)：553-6．

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8王迎春，阮長耿.小劑量糖皮質激素聯合腫節風治療原發性血小板減少性紫癜的初步報告〔J〕.江蘇臨床醫學雜志，2002;6(3)：193-5.

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10鄭筱萸．中藥新藥臨床研究指導原則〔S〕.北京：中國醫藥科技出版社，2002:180-8.

11謝雁嗚，王永炎，翁維良，等．中醫臨床方案優化的思路與方法探析〔J〕.世界科學技術中醫藥現代化，2008;10(1)：22-6.

12王纓，夏為軍．加味小柴胡顆粒及其組方對ITP模型小鼠造血功能的影響〔J〕.中華中醫藥學刊，2008;26(1)：106-8．

〔2014-12-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者：王華(1972-)，女，博士后，副教授，碩士生導師，主要從事臨床醫學研究。

基金項目:婁底市科技局項目(No.2012-211)

〔中圖分類號〕R587.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6343-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.011