內質網應激抑制劑4-苯基丁酸對高果糖喂養誘導小鼠脂肪肝的干預作用及機制

任路平　胡志娟　張　璞　于　賢　宋光耀　陳樹春

(河北省人民醫院內分泌一科，河北　石家莊　050051)

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內質網應激抑制劑4-苯基丁酸對高果糖喂養誘導小鼠脂肪肝的干預作用及機制

任路平胡志娟1張璞于賢宋光耀陳樹春

(河北省人民醫院內分泌一科，河北石家莊050051)

〔摘要〕目的探討內質網應激(ERS)抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)對高果糖飲食誘導小鼠肝臟脂質沉積及脂質從頭合成通路的影響。方法雄性Wistar小鼠分為對照組、高果糖組和4-PBA組(自高果糖喂養第4周后給予4-PBA 1 g·kg-1·d-1)，8 w后處死小鼠并測定各組小鼠空腹血糖(FBG)、空腹血胰島素(FINS)，測定血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)含量及肝臟甘油三酯(TG)含量；測定ERS標志物葡萄糖調節蛋白(GRP)78、GRP94的基因表達；并測定脂質合成標志物固醇調節元件結合蛋白(SREBP)-1c和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的基因表達。結果與對照組相比，高果糖組的FBG、FINS、肝TG均顯著增加(均P<0.01)；與高果糖組比較，4-PBA組的上述指標均顯著降低(均P<0.01)。與對照組相比，高果糖組小鼠的肝內GRP78、GRP94基因表達顯著增加(均P<0.01)，而4-PBA組上述基因表達均低于高果糖組(均P<0.01)。高果糖組小鼠的肝內SREBP-1c和ACC基因表達顯著增加(均P<0.01)，而4-PBA組上述因子基因表達均顯著低于高果糖組(P均<0.01)。結論長期高果糖喂養引起小鼠肝臟脂質沉積、ERS和脂質從頭合成增加，ERS抑制劑4-PBA可改善高果糖飲食誘導的脂肪肝，其機制可能與ERS調控脂質從頭合成有關。

〔關鍵詞〕4-苯基丁酸；甘油三酯；脂肪肝；內質網應激

1河北省人民醫院腎內科

第一作者：任路平(1977-)，女，副主任醫師，博士，主要從事內分泌脂代謝學研究。

在我國，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的發病率逐年升高，膳食因素如果糖過量攝入可促進脂肪肝的發生發展〔1〕，但是發病機制尚未完全明確。既往研究表明，內質網應激(ERS)與脂肪肝的發生發展有關，同時，ERS對肝細胞脂質合成具有調控作用〔2,3〕。本研究通過觀察ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)對果糖誘導的小鼠脂肪肝的干預作用，探討ERS在高果糖喂養誘導脂肪肝中的介導作用及其對脂質從頭合成的調控作用。

1材料和方法

1.1實驗動物成年雄性Wistar小鼠分為對照組、高果糖組和4-PBA組，每組15只，體重250～280 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。對照組進食普通飼料;高果糖組予高果糖飼料，配方參考文獻等〔4〕：果糖34.5%，淀粉34.5%，脂肪9%，蛋白21%；喂養4 w后，4-PBA組每日灌胃給予4-PBA 0.35 g/kg體重；三組每日進食熱量基本相等，喂養16 w后處死小鼠，采血測定相關指標及肝總重量，并留取肝組織。

1.2檢測指標及方法

1.2.1血液學指標測定各組小鼠喂養8 w后禁食10 h，采用快速血糖測定儀測定空腹血糖(FBG)；尾部取血，分離血清,用放射免疫法測定空腹血胰島素(FINS)；全自動生化分析儀測定小鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)。

1.2.2肝臟甘油三酯(TG)測定取肝臟組織30 mg，經氯仿/甲醇抽提TG后，加入0.6%NaCl分離水相和有機相，吸取有機相待干燥后溶于100%乙醇500 μl，應用GPO-PAP試劑盒測定TG含量。

1.2.3肝臟基因表達測定采用Trizol提取組織總RNA,采用SYBRGreen實時檢測的逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測目的基因表達(PE9600熒光定量儀,美國Perkin Elmer)。PCR體系50 μl,5×SYBRGreen 10 μl，2 U/μl Taq酶1.5 μl，25 mmol/L脫氧核苷三磷酸0.5 μl，10 μmol/L上、下游引物各1 μl(引物序列見表1)。cDNA模板5 μl，雙蒸水30 μl。于循環延伸反應最后時刻收集熒光信號。標準曲線制備：10倍梯度稀釋標準品,各取2.5 μl做定量模板,反應體系及條件同上,同時設陰性對照。以稀釋倍數的對數為橫坐標,循環域值(Ct)為縱坐標，軟件分析系統自動繪制出標準曲線,并得到相應各待測樣本的值和起始拷貝數。每組隨機選取6只小鼠進行基因檢測；內參基因為甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)。

1.3統計學方法應用SPSS11.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1實驗8 w后各組小鼠檢測結果比較各組小鼠實驗起始體重無差異，飼料喂養8 w后高果糖組小鼠體重高于對照組(P<0.01)，而4-PBA組體重較高果糖組小鼠明顯減輕(P<0.01)，與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。高果糖組的FBG、FINS較對照組顯著增加(P<0.01)，經4-PBA干預后FBG、FINS較高果糖組顯著降低(P<0.01)。各組小鼠ALT、AST無明顯變化。見表2。

2.2各組小鼠肝臟葡萄糖調節蛋白(GRP)78、GRP94的基因表達水平與對照組相比，高果糖組GRP78、GRP94的mRNA水平顯著增高(P<0.01)，而4-PBA組的GRP78、GRP94 mRNA水平較高果糖組顯著下降(P<0.01)，見表3。

2.3各組小鼠肝臟固醇調節元件結合蛋白(SREBP)-1c和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)基因表達情況與對照組相比，高果糖組SREBP-1c和ACC mRNA水平顯著增高(P<0.01)，而4-PBA組的SREBP-1c和ACC mRNA水平較高果糖組顯著下降(P<0.01)，見表3。

表1　基因檢測引物序列

表2　各組小鼠喂養8 w時的基本指標

與對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與高果糖組比較：3)P<0.01；下表同

表3　各組小鼠肝內ERS標志物及SREBP-1c和

3討論

既往研究已經證明，果糖的過量攝入可促進肝臟脂質沉積〔1〕。膳食因素如果糖的過量攝入與脂肪肝的發生發展有關，主要機制是果糖可刺激肝臟脂質從頭合成。本研究結果顯示，8 w的高果糖喂養誘導了小鼠肝臟脂質沉積，并伴隨著脂質從頭合成因子SREBP-1c和下游脂質合成關鍵酶ACC的基因表達增加，與既往研究〔4〕結果一致，提示果糖通過刺激脂質從頭合成誘導脂肪肝。脂肪肝的發生發展機制尚未完全闡明。在遺傳性肥胖小鼠模型和長期高脂、高果糖喂養小鼠模型中，出現脂肪肝的同時也出現ERS〔2〕。本研究結果發現，經過8 w高果糖飲食喂養，小鼠肝內ERS伴侶分子GRP78、GRP94均明顯升高，提示肝細胞內出現ERS。研究表明通過對ERS的抑制可改善ob/ob小鼠的脂肪肝〔3〕，但是ERS介導脂肪肝發生發展的具體分子機制尚未闡明。一個轉基因小鼠模型表明ERS的非折疊蛋白反應通路PERK-eIF2α通路在肝臟脂質合成的調節中發揮作用〔5〕；另一個ERS的上游調節因子XBP-1基因敲除小鼠發現XBP-1是調控肝臟內源性脂質合成的一個新的上游轉錄因子，可調控ACC2等脂質代謝相關酶類的表達〔6〕；在肥胖小鼠模型中，GRP78和ER內膜的分離可引起上游轉錄因子SREBP-1c的成熟〔7〕，提示ERS可調控內源性脂質合成，可能是ERS介導了NAFLD發生發展的一個機制。

4參考文獻

1Nseir W,Nassar F,Assy N.Soft drinks consumption and nonalcoholic fatty liver disease〔J〕.World J Gastroenterol,2010;16(21):2579-88.

2Ozcan U,Cao Q,Yilmaz E,etal.Endoplasmic reticulum stress links obesity,insulin action,and type 2 diabetes〔J〕.Science,2004;306(5695):457-61.

3Ozcan U.Chemical chaperones reduce ER stress and restore glucose homeostasis in a mouse model of type 2 diabetes〔J〕.Science,2006;313(5790):1137-40.

4Ren LP,Yilmaz E,Ozcan L.Differing endoplasmic reticulum stress response to excess lipogenesis versus lipid oversupply in relation to hepatic steatosis and insulin resistance〔J〕.PLoS One,2012;7(2):30816.

5Oyadomari S,Harding HP,Zhang Y,etal.Dephosphorylation of translation initiation factor 2alpha enhances glucose tolerance and attenuates hepatosteatosis in mice〔J〕.Cell Metab,2008;7(6):520-32.

6Lee S,Spencer ND.Materials science.Sweet,hairy,soft,and slippery〔J〕.Science,2008;319(5863):575-6.

7Kammoun HL,Chabanon H,Hainault I,etal.GRP78 expression inhibits insulin and ER stress-induced SREBP-1c activation and reduces hepatic steatosis in mice〔J〕.Clin Invest,2009;119(5):1201-15.

〔2014-12-19修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：宋光耀(1958-)，男，主任醫師，博士生導師，主要從事內分泌脂代謝學研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81200639)

〔中圖分類號〕R333.4

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6323-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.002