豨薟草提取液對MPP+誘導的PC12細胞損傷的保護作用

張　磊　王彥永　劉　佳　于　靜　楊樹民

(河北醫科大學第一醫院藥劑科，河北　石家莊　050031)

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豨薟草提取液對MPP+誘導的PC12細胞損傷的保護作用

張磊王彥永1劉佳2于靜楊樹民

(河北醫科大學第一醫院藥劑科，河北石家莊050031)

摘要〔〕目的探討豨薟草提取液對1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)損傷的保護作用及機制。方法在生長狀態良好的PC12細胞中加入終濃度為400 μmol/L的MPP+，造成帕金森病(PD)的離體實驗模型，并觀察豨薟草提取液對MPP+誘導的PC12細胞損傷的保護作用。倒置顯微鏡下觀察細胞形態，MTT法檢測細胞活力，通過DCFH-DA熒光探針檢測細胞內活性氧(ROS)水平。結果400 μmol/L MPP+作用PC12細胞能明顯抑制細胞生長，造成細胞發生損傷，ROS水平增加。同時給予不同濃度豨薟草提取液，PC12細胞存活率明顯增加，ROS水平顯著降低。結論豨薟草提取液能有效改善MPP+誘導的PC12細胞的損傷，其作用機制可能與降低ROS水平有關。

關鍵詞〔〕帕金森病；豨薟草；1-甲基-4-苯基吡啶離子；PC12細胞；活性氧

1河北醫科大學第一醫院神內科2河北醫科大學第一醫院營養科

第一作者：張磊(1979-)，男，主管藥師，主要從事臨床藥理學研究。

帕金森病(PD)是發生在中老年期的一種常見慢性神經退行性疾病〔1〕，臨床表現為靜止性震顫、肌強直和運動遲緩等癥狀，病理變化主要為黑質致密區(SN)多巴胺(DA)能神經元進行性死亡或缺失〔2〕。目前該病的發病機制尚不明確，但有研究表明，在PD中選擇性DA能神經元損傷與細胞凋亡密切相關〔3〕。1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)是一種DA能神經元毒性劑，被廣泛應用于PD發病機制和藥效學評價的研究〔4〕。豨薟草為常用中草藥，是一年生草本植物豨薟 、腺梗豨薟或毛梗豨薟的全草〔5〕。據報道，豨薟草有抗炎〔6，7〕、抗風濕〔8〕、降壓〔9，10〕、抗腫瘤〔11〕等多方面的作用。婁月芬等〔12〕研究證明，豨薟草提取液能明顯保護腦缺血再灌注的大腦皮層神經元損傷模型，其機制與豨薟草抗氧化作用有關。但是關于豨薟草提取液治療PD的物質基礎和具體作用機制在國內外還未見報道。本實驗探討豨薟草提取液治療PD的作用和機制。

1材料和方法

1.1主要試劑豨薟草購自河北祁新中藥顆粒有限公司，經河北省藥品檢驗院段吉平主任藥師鑒定為腺梗豨薟的地上部分，水煎煮提取，低溫濃縮，提取物濃度為2 mg/ml(以總黃酮計)；96孔培養板購自美國Corning公司；MTT、DMSO和MPP+均購自Sigma公司；DCFH-DA購自Sigma公司；DMEM培養基，胎牛血清和馬血清購自Gibco BRL公司。

1.2主要儀器倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司產品；IX70)；CO2培養箱(德國，HERAD-63450)；酶標儀(美國 Bio Rad3550)。

1.3細胞培養和藥物處理PC12細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，由本實驗室傳代并保存。PC12細胞置于含5%胎牛血清，10%馬血清的DMEM培養液中，并在含5% CO2的37℃培養箱中培養，細胞每2～3天更換1次培養液，當細胞長到80%即可傳代培養。將生長狀態良好的細胞以2×105/ml接種于96孔培養板，每孔100 μl，24 h細胞貼壁后棄去培養液，每孔加入含不同濃度(100、250、400、550 和700 μmol/L)MPP+和(或)豨薟草提取物的培養液100 μl，繼續培養。

1.4實驗分組實驗分空白對照組：無細胞，并加入不含MPP+的培養液；陰性對照組：細胞正常培養，不給予任何處理試劑；MPP+處理組：MPP+單獨處理PC12細胞；豨薟草提取物+MPP+組：豨薟草提取物設三個濃度(2.00、4.00和8.00 μg/ml)，MPP 濃度為400 μmol/L。每組各設定6個復孔。

1.5細胞形態學觀察將各組細胞放置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態學改變情況并拍照記錄。

1.6MTT比色法檢測細胞增殖活性在培養板上接種處于指數生長期的PC12細胞，每孔加細胞懸液100 μl，接種量2×105/ml，加入等體積、不同濃度的豨薟草提取物或MPP+。MPP+處理組加入含MPP+的等體積溶劑，豨薟草提取物+MPP+組加入等體積的混合溶液，并分別設6個復孔，繼續培養48 h。在結束培養前4 h，每孔加入MTT 溶液20 μl，繼續培養4 h后，棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩5 min后，酶標儀490 nm處檢測每孔的吸光度(A)值。細胞存活率=(陰性對照組A值-空白對照組A值)/(加藥組A值-空白對照組A值)×100%。

1.7PC12細胞內ROS水平的檢測按照試劑盒使用說明書進行操作。PC12細胞內ROS水平采用熒光探針DCFH-DA孵育后，熒光顯微鏡下進行觀察。將PC12細胞接種于24孔培養板，分組干預，每組設定6個復孔。干預結束后，每孔加入DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L，37℃避光孵育60 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察細胞內DCF熒光強度，檢測結果采用HMIAS-2000型圖文分析軟件進行分析。

1.8統計學方法應用SPSS13.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析及q檢驗。

2結果

2.1MPP+對PC12細胞的影響MTT檢測結果顯示，正常 PC12細胞給予不同濃度MPP+(100，250，400，550和700 μmol/L)48 h后，細胞存活率隨藥物濃度的增加而呈劑量依賴性降低〔(88±7.03)%、(77±5.46)%、(56±6.23)%、(32±6.88)%、(26±3.12)%〕。當MPP+濃度在400 μmol/L時，細胞存活率基本維持在60%左右。為使細胞處于損傷狀態又不致使細胞過度死亡，本實驗選擇400 μmol/L的MPP+構建PC12細胞損傷模型。

2.2豨薟草提取液對MPP+損傷的PC12細胞形態學改變的影響正常PC12細胞呈圓形、梭形或多邊形，為貼壁生長細胞，可有一到多條的類似神經突起的細胞突起出現，細胞生長迅速，培養12～24 h后細胞成簇生長，2～3 d后突起明顯增多增長，可見多數突起從細胞邊緣發出，相互連接成網狀，在倒置顯微鏡下呈強折光性，核不易見。加入MPP+損傷后，細胞先腫脹，折光度增強后，細胞圓縮、脫落。400 μmol/L的MPP+作用于PC12細胞后4～5 h即可見部分細胞體腫脹，細胞形態改變，折光減弱，作用24 h后，大部分PC12細胞胞體變小、變圓，失去折光性，細胞突起明顯減少、縮短，細胞之間的突起連接明顯減少。細胞可由貼壁生長脫落到細胞培養液中懸浮，隨著培養時間的延長活細胞逐漸減少。經過豨薟草提取液處理的PC12細胞，細胞形態學的改變與模型組PC12細胞比較有明顯的改善。在顯微鏡下見活細胞數明顯增加，細胞的脫落率下降，細胞的貼壁率提高，細胞折光性增加，細胞間仍可見比較多的細胞聯系，細胞仍以簇狀生長為主，散在單一的細胞較少，接近正常組細胞。豨薟草提取液能明顯改善PC12細胞的損傷狀態(圖1)。

2.3豨薟草提取液對MPP+損傷的PC12細胞存活率的影響MTT結果顯示，400 μmol/L MPP+導致PC12細胞存活率較對照組明顯下降〔(54±4.24)%vs(100±7.11)%〕，同時給予不同濃度豨薟草提取液可增加細胞存活率，在2.00、4.00、8.00 μg/ml范圍內具有濃度依賴性，其中4.00〔(72±6.14)%〕和8.00 μg/ml〔(81±6.71)%〕濃度組與MPP+處理組比較差異顯著，表明豨薟草提取液對MPP+誘導PC12細胞凋亡具有一定的抑制作用。

2.4MPP+與豨薟草提取液對PC12細胞ROS的影響MPP+與PC12細胞孵育48 h后，細胞內ROS水平明顯高于對照組(507±27 vs 230±20，P<0.01)。加入8.00 μg/ml的豨薟草提取液干預后細胞內ROS水平明顯低于MPP+組〔(348±25)，P<0.05〕。見圖2。

A：對照組 B：MPP+處理組；C：4.00 μg/ml豨薟草提取物+MPP+ 處理組，下圖同圖1　豨薟草提取液對MPP+損傷的PC12細胞形態學觀察(×100)

圖2　DCFH-DA 檢測細胞內ROS(×100)

3討論

PD殘留的神經元內出現以異常修飾和聚集的突觸核蛋白為主要成分的嗜酸性包涵體——路易體(LB)〔13〕。目前PD的發病機制仍不明確，許多學者認為氧化應激損害，尤其是DA通過非酶促的自氧化產生活性氧簇(ROS)可能是導致DA能神經元選擇性損傷的重要原因〔14〕。PC12細胞為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，它能表達酪氨酸羥化酶并且合成多巴胺，因而也被稱為多巴胺能細胞。MPP+是1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)在體內的代謝產物，MPP+作用于PC12細胞建立的細胞模型已得到國內外學術界公認，并被廣泛用于PD的實驗研究〔15〕。本研究發現，與陰性對照組比較，MPP+處理組細胞活性降低，ROS水平升高；而豨薟草提取液對細胞活性的降低和細胞內ROS水平的升高具有抑制作用。因此，我們推測豨薟草提取液可能通過抑制細胞內ROS的水平，減少神經元的損傷，從而發揮抗PD的作用。但豨薟草對神經元凋亡的具體作用及保護機制、信號轉導等還有待于進一步研究。

參考文獻4

1Bezard E，Przedborski S.A tale on animal models of Parkinson's disease.Movement disorders〔J〕.Off J Movement Disord Soc，2011；26(6)：993-1002.

2Fahn S.The spectrum of levodopa-induced dyskinesias〔J〕.Ann Neurol,2000;47(4 Suppl 1)：S2-9.

3Levy OA，Malagelada C，Greene LA.Cell death pathways in Parkinson's disease：proximal triggers，distal effectors，and final steps〔J〕.Apoptosis,2009；14(4)：478-500.

4Singer TP，Ramsay RR.Mechanism of the neurotoxicity of MPTP.An update〔J〕.FEBS Lett，1990；274(1-2)：1-8.

5張豐強.臨床大本草〔M〕.北京：華夏出版社，2000：887-9.

6孫貴才，于雪峰，李登宇，等.復方豨薟草膠囊治療反復性關節炎的臨床療效觀察〔J〕.中醫藥信息，2007;24(2)：34-5.

7Park HJ，Kim IT，Won JH，etal.Anti-inflammatory activities of ent-16alphaH，17-hydroxy-kauran-19-oic acid isolated from the roots of Siegesbeckia pubescens are due to the inhibition of iNOS and COX-2 expression in RAW 264.7 macrophages via NF-kappaB inactivation〔J〕.Eur J Pharmacol,2007;558(1-3)：185-93.

8胡慧華，湯魯霞，李小猛.豨薟草生品和炮制品抗炎、抗風濕作用的實驗研究〔J〕.中國中藥雜志，2004;29(6)：542-5.

9Kang BK，Lee EH，Kim HM.Inhibitory effects of Korean folk medicine 'Hi-Chum' on histamine release from mast cells in vivo and in vitro〔J〕.J Ethnopharmacol,1997;57(2)：73-9.

10Wang GJ，Shan J，Pang PK，etal.The vasorelaxing action of rutaecarpine：direct paradoxical effects on intracellular calcium concentration of vascular smooth muscle and endothelial cells〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,1996;276(3)：1016-21.

11汪建平，羅瓊，阮金蘭，等.豨薟草對人宮頸癌HeLa細胞的體外抑制效應〔J〕.醫藥導報，2009;28(1)：45-6.

12婁月芬，李盈，胡濱.豨薟草總黃酮對大鼠腦缺血損傷的保護作用及其作用機制研究〔J〕.藥學實踐雜志，2013;31(1)：42-4.

13Blum D，Torch S，Lambeng N，etal.Molecular pathways involved in the neurotoxicity of 6-OHDA，dopamine and MPTP：contribution to the apoptotic theory in Parkinson’s disease〔J〕.Prog Neurobiol，2001;65(2)：135-72.

14Hashimoto M，Hsu IJ，Xia Y，etal.Oxidative stress induces amyloid-like aggregate formation of NACP/alpha-synuclein in vitro〔J〕.Neuroreport，1999;10(4)：717-21.

15Kang D，Miyako K，Kuribayashi F，etal.Changes of energy metabolism induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium(MPP+)-related compounds in rat pheochromocytoma PC12 cells〔J〕.Arch Biochem Biophys,1997;337(1)：75-80.

〔2015-06-17修回〕

(編輯曹夢園)

通訊作者：王彥永(1976-)，男，副主任醫師，碩士生導師，主要從事腦小血管病研究。

中圖分類號〔〕R742.5〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7042-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.033