Toll樣受體-9在細菌DNA誘導小鼠心肌炎癥反應中的作用

周秀華　方麗卉

(中國醫科大學第四醫院重癥醫療科，遼寧　沈陽　110032)

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Toll樣受體-9在細菌DNA誘導小鼠心肌炎癥反應中的作用

周秀華方麗卉

(中國醫科大學第四醫院重癥醫療科，遼寧沈陽110032)

摘要〔〕目的探討Toll樣受體-9(TLR-9)及其致病性配體(即細菌DNA)在膿毒癥小鼠心肌炎癥反應中心功能不全的作用。方法使用人工合成的細菌DNA(CpG-ODN)，分別作用于TLR-9組 及TLR-9缺陷(TLR9-D)的小鼠，測定6 h時間點炎癥標志物：腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β及IL-6、血清腦鈉肽(BNP)水平及心動超聲的心功能結果。結果在野生型小鼠，CpG-ODN導致心臟發生嚴重炎癥反應，表現為TNF-α、IL-1β，IL-6及BNP的水平升高及心動超聲示心臟收縮機舒張功能明顯降低(P<0.05)；而在TLR9-D小鼠這種炎癥反應卻沒有出現。結論細菌DNA通過TLR-9的介導，導致心肌炎性反應及細胞因子的生產并且產生心功能不全,TLR-9與心功能不全呈正相關。

關鍵詞〔〕膿毒癥；TLR-9；感染；炎癥；心肌細胞；心功能不全；腦鈉肽

第一作者：周秀華(1965-)，女，碩士，主任醫師，碩士生導師，主要從事冠心病重癥研究。

心血管功能障礙是膿毒癥的嚴重并發癥，膿毒癥患者并發心血管功能障礙的概率逐漸上升可達40%〔1〕，并使死亡率增加20%～70%〔2〕。在膿毒癥的相關試驗中，血液中可檢測到較高水平的腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β〔3〕等細胞因子。目前，對心肌中Toll樣受體(TLR)-9的作用仍知之甚少，但是在鼠心臟中已檢測到其基本表達。有研究提示，TLR-9作為CpG DNA的受體分子在膿毒癥心肌損傷過程中可能扮演著關鍵角色〔3〕。本研究探討TLR-9在細菌DNA誘導心肌炎癥反應中腦鈉肽(BNP)的作用。

1材料與方法

1.1實驗動物由中國醫科大學試驗動物中心提供C57BL/6基因背景的小鼠即TLR-9正常型(野生型)，TLR-9缺陷(TLR09-D)小鼠(日本滋賀大學提供)參加實驗的C57BL/6小鼠及TLR9-D小鼠均為6～8周齡，雌雄各半，體重(18±2)g。野生型小鼠(TLR-9組)20只，TLR-9缺陷(TLR9-D組)小鼠20只。

1.2CpG-ODN腹腔內注射兩組小鼠腹腔內注射1 mg/kg的D-半乳糖胺致敏，30 min后，再次注射1 nmol/g的CpG-ODN(ODN 1668 FITC;深圳欣博盛生物科技有限公司)。CpG-ODN為人工合成，不含內毒素，溶解于無內毒素的水中后使用。

1.3兩組超聲心動圖及心功能的比較THONOS2500心臟彩色超聲診斷儀(美國惠普公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，6 h時用NOS2500心臟彩色超聲診斷儀及7.5 MHz相控陣探頭無創檢測小鼠心功能評價心功能：左室收縮末期內徑(LVEDs)、左室舒張末期內徑(LVEDd)、室間隔厚度(IVST)、左室射血分數(LVEF)、左室縮短率(LVFS)。

1.4血TNF-α，IL-1β、IL-6及BNP檢測6 h從腹主動脈穿刺獲得血液樣本。3 000 r/min離心血液10 min，并將上層清液(血漿)，測定TNF-α，IL-1β、IL-6和BNP，使用ELISA法(美國BIO-TEX全自動酶標儀，ELISA檢測試劑盒上海藍基生物技術有限公司)

1.5統計學處理采用SPSS16.0統計軟件行t檢驗。

2結果

2.1臨床表現腹腔內先后注射D-半乳糖胺及CpG-ODN后，TLR9正常組(野生小鼠組)出現膿毒癥樣癥狀，如精神萎靡、腹瀉、口吐泡沫機氣喘等；而缺陷小鼠TLR9-D仍保持實驗前狀態，沒有出現類似的炎癥反應征象。

2.2兩組心肌超聲心動圖、心功能及炎癥因子水平比較見表1，表2。

指標TLR-9-D組TLR-9正常組LVEDs(mm)2.26±0.184.83±0.531)LVEDd(mm)4.98±0.297.82±0.621)IVST(mm)0.98±0.091.35±0.151)LVEF(%)78.23±0.7960.50±2.521)LVFS(%)44.76±0.8231.82±2.021)

與TLR-9-D組比較：1)P<0.05，下表同

組別TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)BNP(pmol/L)TLR-9-D組39.44±5.5412.85±1.3941.01±4.28209.3±55.23TLR-9正常組50.23±7.661)27.0±5.9541)49.63±1.871)1203±136.211)

3討論

隨著膿毒癥的增加，膿毒癥所致的心肌損傷是非冠心病ICU中致死的首要原因；目前針對其發生發展機制已提出了幾種假說：①細菌細胞壁成分LPS的增多〔3〕；②各種細胞因子如IL-1β和TNF-α的產生增多〔4〕；③活性氧/氮等物質增多〔4〕。有研究提出，在體內模型中，TLR4和CD14的缺陷可消除LPS誘導的心肌收縮功能障礙。類似的試驗也提出，金黃色葡萄球菌通過TLR2的介導使心肌發生功能障礙。這提示TLR系統可能在此過程中發揮重要作用。激活高等動物天然免疫應答的病原體相關分子模式(PAMPs)廣泛存在于病原體細胞表面，PAMPs的識別是Toll樣受體(TLRs)家族介導的。細菌 DNA基因組中的未甲基化CpG模體的出現頻率比在高等動物中高得多，高等動物免疫系統通過TLR-9來察覺病原體中的未甲基化CpG 模體，而不識別自身的DNA。TLR-9是TLR 家族的Ⅰ型膜蛋白，在B細胞、樹突細胞(DC)等免疫細胞中表達，TLR-9對CpG DNA的識別作用是CpG結構特異性的，TLR-9可介導CpG激活DC、B細胞、巨噬細胞等，并誘導細胞分泌炎癥因子和Th1型細胞因子，從而激活天然和適應性免疫應答。

細菌DNA(CpG-ODN)可能通過TLR-9啟動先天應答，導致膿毒癥休克。TLR-9定位于內質網，并在CpG的刺激下招募到內體小泡〔5〕。此后，TLR9與CpG-ODN共定位導致細胞的活化。針對配體結合的研究表明，細菌DNA直接與TLR-9結合，再與銜接分子MyD88相作用，導致IL-1受體相關激酶家族和絲裂原活化蛋白激酶的激活。

本實驗TLR-9缺陷的動物TNF-α，IL-1β及BNP水平明顯低于TLR-9正常組，對于超生心動圖所示的心衰指標(LVEDs、LVEDd、IVST、LVEF及LVFS)兩組也存在明顯差異。而BNP作為心衰的標志物已得到共識〔6〕。

TLR-9缺陷動物細胞對CpG-ODN的攝取比較緩慢。而在野生型小鼠(TLR-9正常組)，CpG-ODN所引起的TLR-9 mRNA和蛋白質的上調具卻有顯著的時間依賴性。

在野生型小鼠，CpG-ODN導致血液TNF-α，IL-1β、IL-6和BNP水平的表達的顯著增加。此外，TNF-α，IL-1β和IL-6的血漿水平增加表明在野生型動物出現了全身性炎癥反應。BNP水平升高說明炎癥反應較重，故導致心肌損害較重；相比之下，在TLR-9缺陷小鼠CpG-ODN刺激后上述細胞因子的水平沒有較大變化。

目前研究表明，在體內，心肌的某些炎癥反應是TLR-9依賴性的，而這種反應在TLR-9缺陷動物是不存在的。

綜上，細菌DNA在TLR-9的介導下，可導致心肌的炎癥反應及功能障礙。TLR-9在細菌DNA配體CPG-ODN的作用下，通過大量產生TNF-α，IL-1β和IL-6，造成心肌細胞炎癥損傷，所以炎癥反應激烈的小鼠心衰出現的較早及較重。而TLR-9的缺失將阻斷這一進程。膿毒癥動物心肌損傷過程中，TLR-9扮演關鍵角色。

參考文獻4

1姚詠明,盛志勇.膿毒癥防治學〔M〕.北京:科學技術出版社,2008：23-4.

2Parrillo JE,Parker MM,Natanson C,etal.Septic shock in humans.Advance in the understanding of pathogenesis,cardiovascular dysfunction and therapy〔J〕.Ann Int Med,1990;113(2):27-42.

3方麗卉，周秀華.TLR-9在細菌DNA誘導小鼠心肌炎癥反應中的應用〔J〕.中國醫師雜志，2014;1(1):100-2.

4Khadour FH,Panas D,Ferdinandy P,etal.Ehanced NO and superoxide generation in dysfunctional hearts from endotoximic rats〔J〕.Am J Physiol,2002;283(3):1108-15.

5Latz E,Schoenemeyer A,Visintin A，etal.TLR9 signals after translocating from the ER to CpG DNA in the iysosome〔J〕.Nat Immunol,2004;5(2):190-8.

6朱學明.血漿腦鈉素和心鈉素在心力衰竭中的診斷價值及評價〔J〕.中華檢驗醫學雜志，2006；10(1)：29.

〔2014-12-29修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：遼寧省自然科學基金項目(No.2011022562011)

中圖分類號〔〕R631〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-6987-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.009