胰高血糖素樣肽-1對肥胖2型糖尿病大鼠胰島素敏感性的改善作用

王晉竹　葛　鳳　婁　寧　胡曉琳　董振華　王文匯

(山東大學齊魯醫院(青島)內分泌科,山東　青島　266011)

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胰高血糖素樣肽-1對肥胖2型糖尿病大鼠胰島素敏感性的改善作用

王晉竹葛鳳婁寧1胡曉琳1董振華1王文匯

(山東大學齊魯醫院(青島)內分泌科,山東青島266011)

摘要〔〕目的探討胰高血糖素樣肽(GLP)-1對肥胖2型糖尿病(T2DM)大鼠胰島素敏感性的改善作用及機制。方法12只6周齡雄性SD大鼠隨機分為T2DM組、T2DM +GLP-1組及正常對照組(NC組)。T2DM組及T2DM +GLP-1組高脂喂養、NC組普食喂養4 w，給予T2DM組及T2DM +GLP-1組鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg腹腔注射建立T2DM模型。受試大鼠進行高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗。T2DM +GLP-1組大鼠在鉗夾實驗前30 min開始持續輸注GLP-1，檢測鉗夾實驗120 min葡萄糖輸注率及0、30、60、90、120 min血清胰島素濃度。Wester印跡法測定大鼠腓腸肌絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)磷酸化水平。結果與NC組比較，T2DM組鉗夾實驗120 min葡萄糖輸注率降低(P<0.05),骨骼肌Akt磷酸化水平下降；與T2DM組比較，T2DM +GLP-1組鉗夾實驗120 min葡萄糖輸注率增加(P<0.05)，骨骼肌Akt磷酸化水平升高；各組間胰島素濃度變化無差異(P>0.05)。結論GLP-1可以增加平靜狀態T2DM大鼠葡萄糖攝取，改善骨骼肌的胰島素敏感性，這一改善作用不依賴于胰島素濃度的增加。

關鍵詞〔〕胰高血糖素樣肽-1；2型糖尿病大鼠；胰島素敏感性；高胰島素-正葡萄糖鉗夾；骨骼肌

1山東大學附屬濟南市中心醫院內分泌科

第一作者：王晉竹(1988-),女,在讀碩士,主要從事糖尿病胰島素抵抗的分子機制研究。

胰高血糖素樣肽(GLP)-1作為腸促胰素家族的重要一員，主要通過刺激胰島β細胞分泌胰島素和抑制α細胞分泌胰高糖素發揮降糖作用，還能增加胰島β細胞數量、延緩胃排空、抑制食欲、降低血脂、減輕體重、抗炎及保護心血管等，并且能影響機體的胰島素敏感性。研究發現，給予胰島素抵抗的肥胖Zucker(fa/fa)大鼠GLP-1類似物治療6 w，可以產生胰島β細胞團及胰島素敏感性均增加的聯合效應〔1〕。本課題組前期研究發現，持續輸注GLP-1能增加急性胰島素抵抗大鼠的骨骼肌微循環灌注及絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)磷酸化水平，提高骨骼肌對葡萄糖的攝取，增加骨骼肌胰島素敏感性〔2〕。而對于伴有胰島β細胞功能下降、胰島素分泌減少的肥胖2型糖尿病(T2DM)大鼠胰島素敏感性是否仍有改善作用，目前未見報道。本研究擬探討GLP-1對T2DM大鼠胰島素敏感性的改善作用及機制。

1材料和方法

1.1實驗動物SPF級成年雄性SD大鼠12只，體重160～180 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2試劑與儀器GLP-1(7-36)amide(美國Baehem公司)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；檸檬酸鈉緩沖液(北京Solarbio公司)；50%葡萄糖(天津新鄭股份有限公司)；普通速效胰島素(禮來蘇州制藥有限公司)；拜耳血糖儀及配套拜安康試紙(德國Bayer公司)；胰島素酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(北京優尼康生物科技有限公司)；抗Akt及其磷酸化抗體(美國Cell Signaling公司)；HRP標記山羊抗兔/鼠IgG(北京鼎國昌盛公司)；多功能凝膠成像化學發光儀(美國Cell Biosciences公司)；微量注射泵(保定申辰泵業有限公司)；動物血壓監測儀(美國Harvard Apparatus)。

1.3動物模型構建12只6周齡SD大鼠隨機分為T2DM組、T2DM+GLP-1組、正常對照組(NC組)，每組4只。T2DM組和T2DM+GLP-1組高脂飼料喂養4 w，過夜禁食不禁水12 h，稱體重，STZ以30 mg/kg一次性腹腔內注射，繼續給予高脂飲食。分別于第3、7天檢測尾靜脈血糖，當隨機血糖≥16.8 mmol/L時，T2DM模型大鼠建造成功。

1.4動物手術大鼠隔夜禁食不禁水。稱重，5%戊巴比妥鈉1.2 mg/kg腹腔內注射。麻醉完全后仰臥位固定，沿頸部中線切開大鼠皮膚，依解剖層次鈍性分離組織，行氣管、左側頸內動脈及雙側頸外靜脈插管。左側頸內動脈插管與連有動態血壓監測儀的戊巴比妥鈉微量注射泵連接；右側頸靜脈插管通過三通管分別連接葡萄糖及胰島素的微量注射泵，T2DM+GLP-1組左側頸靜脈插管連接GLP-1微量注射泵。所有操作完成后將大鼠靜置約30 min左右待麻醉狀態穩定。

1.5高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗鉗夾實驗0 min時測定大鼠動脈血糖，同時以3 mIU·kg-1·min-1的速率持續輸注胰島素，實驗2 min時以2 μl/min的速率持續輸注30%葡萄糖，120 min時鉗夾實驗結束。期間每10 min測動脈血糖一次，根據血糖水平調整葡萄糖輸注速率，維持血糖水平在基礎值10%左右，于0、30、60、90、120 min采集動脈血，離心取上清，-20℃儲存用于測定胰島素水平。T2DM+GLP-1組大鼠于鉗夾實驗前30 min開始以30 pmol·kg-1·min-1速率持續輸注GLP-1直至實驗結束。實驗過程中根據動態血壓適當調整戊巴比妥鈉輸注量，以維持大鼠的麻醉狀態穩定。

1.6血糖及胰島素水平測定采用便攜式血糖儀測定全血血糖，ELISA測定血清胰島素水平。

1.7Western 印跡法測定AKt磷酸化水平用RIPA裂解液提取腓腸肌蛋白，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉膜后封閉2 h，加一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加二抗室溫2 h，TBST洗膜3次，ECL發光液滴膜，暗室顯影拍照。

1.8統計學分析應用SPSS19.0統計軟件處理。三組間數據比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2結果

2.1各組大鼠葡萄糖輸注率比較在120 min鉗夾實驗結束時，T2DM組葡萄糖輸注率較NC組降低約54%(P<0.05)；T2DM+GLP-1組葡萄糖輸注率較NC組降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；與T2DM組相比，T2DM+GLP-1組葡萄糖輸注率增加約51%(P<0.05)，見圖1。

與NC組比較：1)P<0.05；與T2DM組比較：2)P<0.05圖1　各組大鼠葡萄糖輸注率比較

2.2各組大鼠血清胰島素濃度比較T2DM+GLP-1組持續輸注GLP-1后實驗0 min與-30 min相比胰島素濃度無差異(P>0.05)，各組間同一時間點胰島素濃度差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2　各組大鼠血清胰島素濃度比較

2.3各組大鼠平均動脈血壓比較T2DM+GLP-1組鉗夾實驗-30 min、NC組與T2DM組鉗夾實驗0 min時無統計學差異(P>0.05)。持續輸注GLP-1后，T2DM+GLP-1組血壓在鉗夾實驗0 min時較-30 min下降約15%(P<0.01)，見圖3。

與-30 min比較：1)P<0.05圖3　各組大鼠平均動脈壓比較

2.4腓腸肌Akt磷酸化表達T2DM組Akt磷酸化水平較NC組降低約53%，差異有統計學意義(P<0.01)，T2DM+GLP-1組Akt磷酸化水平較NC組差異無統計學意義(P>0.05)；持續輸注GLP-1干預后，與T2DM組相比，T2DM+GLP-1組Akt磷酸化水平升高了約55%(P<0.01)，見圖4。

與NC組比較：1)P<0.01；與T2DM組比較：2)P<0.01圖4　腓腸肌的磷酸化Akt表達水平比較

3討論

作為近年來治療糖尿病的新一類藥物，GLP-1的生理作用及其機制受到廣泛關注。GLP-1主要通過葡萄糖濃度依賴性促胰島素分泌及抑制胰高血糖素分泌發揮降糖作用，還能減弱胃腸道蠕動、延緩胃排空、降低食欲和食物攝入，減輕體重〔3〕。研究發現，給予胰腺部分切除的T2DM大鼠GLP-l受體激動劑Exentin-4能誘導胰島β細胞的再生；采用GLP-1培養新鮮分離的人類胰島可抑制β細胞的凋亡〔4,5〕，提示GLP-1有增加胰島β細胞數量的作用。多項研究還發現，GLP-1可以通過增加心肌葡萄糖攝取增強心肌收縮力，改善左心室功能及血管內皮細胞功能紊亂〔6～8〕，從而達到保護心血管的作用。近年來在治療肥胖T2DM患者時發現，GLP-1能升高血清Ⅲ型腺苷酸環化酶(AC3)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，降低甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的作用〔9〕。另外，GLP-1還能直接或間接影響免疫功能，產生抗炎作用〔10〕。GLP-1的這些生理作用與改善胰島素抵抗建立了必然的聯系。Parlevliet等〔11〕給胰島素抵抗大鼠腹腔注射GLP-1受體激動劑4 w后發現，大鼠基礎肝葡萄糖和極低密度脂蛋白(VLDL)的輸出減少；同時通過高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗發現胰島素敏感性增加。本課題組在前期研究發現GLP-1可以通過改善骨骼肌微循環灌注增加機體胰島素敏感性〔2，12〕。本實驗結果說明輸注GLP-1對T2DM大鼠胰島素敏感性也有明顯的改善作用。

輸注GLP-1并未產生對T2DM大鼠β細胞的刺激效應，GLP-1干預帶來的大鼠葡萄糖輸注率的增加，并非通過GLP-1刺激β細胞釋放胰島素的作用產生。GLP-1對β細胞的促胰島素釋放作用依賴于升高的葡萄糖濃度。由于受試大鼠實驗過程呈空腹狀態，鉗夾實驗時通過持續泵入高濃度胰島素及不斷調節葡萄糖輸注率使血糖始終維持在基礎水平，故未升高的血糖水平不足以使GLP-1產生刺激β細胞分泌胰島素的作用，說明鉗夾實驗中GLP-1增加肥胖2型糖尿病大鼠的葡萄糖輸注率，并非通過增加胰島素分泌量這一途徑實現的。

骨骼肌是葡萄糖最大的儲存和利用器官，胰島素調節的葡萄糖利用在骨骼肌占75%～95%。Vincent等〔13〕研究發現，在給予正常SD大鼠持續輸注胰島素30 min后骨骼肌微循環血流量增加，而一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)可抑制胰島素誘導的早期骨骼肌微循環灌注及一氧化氮合酶(eNOS)的產生，還能抑制部分骨骼肌葡萄糖攝取率，說明骨骼肌的葡萄糖代謝與胰島素介導微血管的開放有關。本課題組對正常大鼠的研究也發現，輸注GLP-1能改善骨骼肌微循環灌注及胰島素轉運，有效增加骨骼肌Akt磷酸化水平，并伴有后肢骨骼肌葡萄糖攝取的明顯增加〔2〕。本研究結果顯示，GLP-1干預的T2DM大鼠骨骼肌Akt的磷酸化水平顯著高于GLP-1未干預組。推測在T2DM大鼠，GLP-1也是通過改善骨骼肌微循環灌注，促進胰島素通過內皮細胞PI3K-Akt-eNOS信號傳導途徑介導骨骼肌微血管開放進行跨內皮轉運，進入骨骼肌間隙與肌細胞膜受體結合，增加骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取和利用〔14〕。

GLP-1對動脈血壓的影響目前結果不完全一致。Barragan等〔15〕報告，GLP-1(7-36)酰胺通過非兒茶酚胺作用機制增加大鼠的平均動脈血壓；Vilsb〔16〕則發現每天給予GLP-1類似物治療的T2DM患者，動脈血壓有所下降；Cabou等〔17〕進行3 h高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗，并同時持續注入大鼠側腦室GLP-1受體激動劑，發現大鼠股動脈血壓降低；Yu等〔18〕在給Dahl鹽敏感型高血壓大鼠注射GLP-1后，血管周圍自主神經對乙酰膽堿的反應增加，誘導血管舒張增加。本課題組前期研究發現，通過對正常和胰島素抵抗大鼠進行GLP-1干預后，骨骼肌微循環血流灌注量較基礎值顯著提高，但大鼠平均動脈血壓無改變〔2〕。本研究發現GLP-1干預后平均動脈血壓較未干預前下降，但這一降低作用并未影響鉗夾實驗中葡萄糖輸注率的改善。考慮肥胖T2DM大鼠的腎素-血管緊張素系統(RAS)處于激活狀態，血管內皮分泌的縮血管因子較舒血管因子增多，全身血管處于相對收縮狀態。GLP-1可能是通過與其受體結合激活下游通路信使PKA，活化eNOS，增加NO釋放〔19,20〕，從而糾正血管內皮細胞功能紊亂，起到舒張血管的作用。這一作用獨立于GLP-1對骨骼肌微循環灌注的改善和胰島素敏感性的增加。

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〔2015-01-08修回〕

(編輯李相軍)

Effects of glucagon-like peptide-1 improving insulin sensitivity in obese type 2 diabetic rats

WANG Jin-Zhu,GE Feng,LOU Ning,etal.

Department of Endocrinology,Qilu Hospital,Shandong University,Qingdao 266011,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of Glucagon-like peptide(GLP)-1acted with insulin sensitivity in obese type 2 diabetic(T2DM)rats.MethodsTwelve SD rats were randomized into T2DM,T2DM+GLP-1 and normal control(NC)groups.Rats of T2DM and T2DM+GLP-1 groups were fed with high fat diet for four weeks.The glucose infusion rate at 120 min and insulin concentration at 0,30,60,90,120 min were measured by Hyperinsulinemic-euglycemic clamps.The gastrocnemius serine/threonine protein kinase(Akt)phosphorylation was measured by Western blot.ResultsCompared with that of NC group,the glucose infusion rate at 120 min of T2DM group was lower〔(3.03±1.39)vs(6.52±1.73)mg·kg-1min-1,P<0.05〕,the skeletal muscle Akt phosphorylation levels of T2DM group was decreased.Compared with that of T2DM group,the glucose infusion rate at 120 min of T2DM+GLP-1 group was raised〔(6.09±1.75)vs(3.03±1.39)mg·kg-1min-1,P<0.05〕,so do the Akt phosphorylation levels of skeletal muscle in T2DM+GLP-1 group.There was no difference of insulin concentration among three groups.ConclusionsGLP-1 increases glucose uptake and improves insulin sensitivity of skeletal muscle in tranquility status of T2DM rats.This action of GLP-1 is not with an increase of blood insulin concentration.

【Key words】Glucagon-like peptide-1;Type 2 diabetic rats;Insulin sensitivity;Hyperinsulinemic-euglycemic clamps;Skeletal muscle

通訊作者：王文匯(1963-),女,教授,博士生導師,主要從事糖尿病胰島素抵抗的分子機制研究。

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81070632)；中華醫學會糖尿病臨床醫學科研專項資金(12030490349)

中圖分類號〔〕R587.1〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-6984-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.008