右歸丸對骨髓間充質干細胞成脂分化相關基因甲基化的影響

楊　鋒　潘　樂　馬秋濤　張　濤　楊利學　李彥民

(陜西中醫藥大學附屬醫院骨科，陜西　咸陽　712083)

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右歸丸對骨髓間充質干細胞成脂分化相關基因甲基化的影響

楊鋒潘樂馬秋濤張濤楊利學李彥民

(陜西中醫藥大學附屬醫院骨科，陜西咸陽712083)

摘要〔〕目的探討右歸丸含藥血清對骨髓間充質干細胞成脂分化相關基因表達及其甲基化影響。方法制備右歸丸含藥血清備用。無菌條件下，取SD大鼠骨髓間充質干細胞，貼壁法培養，傳代。第二代貼壁細胞分組：(1)對照組：用含10%鹽水的DMEM培養；(2)成脂誘導組：用成脂誘導條件培養基培養；(3)右歸丸組：10%右歸丸含藥血清加成脂誘導條件培養基；分別干預3 d后用RT-PCR及甲基化特異性PCR法檢測PPARγ和C/EBPα基因表達和甲基化狀態。結果右歸丸組PPARγ和C/EBPα的表達明顯低于其他各組(P<0.05)。右歸丸組PPARγ和C/EBPα甲基化上調，組間比較差異顯著(P<0.05)。結論右歸丸含藥血清可通過去甲基化的表觀遺傳調控機制抑制骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化。

關鍵詞〔〕補腎藥；骨髓間充質干細胞；成脂分化；甲基化

第一作者：楊鋒(1977-)，男，副教授，博士，碩士生導師，主要從事中醫藥防治骨與關節退行性疾病研究。

DNA甲基化是最早發現的表觀遺傳修飾途徑之一，可造成基因的失活。表觀遺傳修飾是在核苷酸序列不發生改變的情況下，通過甲基化、乙酰化等手段最終導致可遺傳的表型變化〔1〕。骨髓間充質干細胞(BMSCs)中DNA序列沒有改變，但是可以分化成不同功能的細胞。表觀遺傳調控BMSCs分化已經成為科學研究的熱點和前沿領域〔2，3〕。本文通過研究補腎名方右歸丸對BMSCs成脂分化相關基因甲基化的影響，旨在一定程度上闡明中醫“腎主骨、生髓”理論的科學內涵。

1材料與方法

1.1動物、儀器及試劑選4周齡SD大鼠，清潔級，體質量(180±20)g，雌雄各半，飼養于陜西中醫學院實驗中心飼養室，實驗大鼠均由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。許可證號：SCXK(陜)2012-003。CO2細胞培養箱(德國Heraeus)，AE21倒置顯微鏡(Olympus)，流式細胞儀(Bechman Epicx)，熒光定量PCR儀(美國ABI 7300)，紫外分光光度儀UV-2300，臺式高速離心機(Eppendorf)，基因組DNA抽提試劑盒(QIAGEN)，甲基化修飾試劑盒(QIAGEN)，PCR試劑盒(上海捷蘭)，隨機引物(華大基因)。

1.2方法

1.2.1中藥含藥血清的制備右歸丸處方組成：熟地24 g、山萸肉9 g、枸杞子9 g、當歸9 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、山藥12 g、杜仲12 g、附子6 g、肉桂6 g。分別加水煎制，并根據“人與動物體表面積折算等效劑量比率表”計算臨床等效劑量，2次/d，灌胃給藥，1 ml/次，連續灌胃3 d，第3天下午灌胃后1 h，給予大鼠麻醉后經腹主動脈采血、1 500 r/min 10 min離心后抽濾、56℃滅活、-20℃凍存備用。

1.2.2實驗分組對照組：L-DMEM，10%胎牛血清，1%青、鏈霉素。成脂誘導組：L-DMEM，20%空白血清，1%青、鏈霉素，成脂誘導劑(10～6 mol/L地塞米松，0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，100 μmol/L吲哚美辛，胰島素10 mg/L)。右歸丸組：成脂誘導培養液加10%右歸丸含藥血清。

1.2.3BMSCs的分離、培養SD大鼠經腹腔氯胺酮麻醉后處死，75%酒精浸泡5 min，無菌條件下取出雙側股骨和脛骨，咬骨鉗修剪骨端，暴露髓腔，5 ml注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培養基反復沖洗髓腔，直到骨質外觀微微透亮。10 cm培養皿收集骨髓沖洗液，37℃、5%CO2孵箱培養。每3 d換液1次。第4 代培養細胞進行流式細胞儀檢測，結果顯示細胞均一性較好，其中CD34、CD45表達呈陰性，而CD90 、CD105 表達呈陽性，陽性率分別為93.136%和93.182%，提示培養所得細胞為主要是BMSCs，非造血性細胞。用細胞計數板作有核細胞計數，調整細胞濃度為5×104/ml，以備實驗之用。

1.2.4RT-PCR 檢測成脂及成脂相關基因表達誘導分化第14天，按照試劑盒說明提取各組細胞總RNA，反轉錄及實時熒光定量PCR檢測PPARγ、C/EBPα的mRNA表達。各基因引物序列：GAPDH正義：5′-AATGATCCGTTGTGGATCTGA-3′，反義：5′-CCTGCTTCACCACCTTCT-3′；PPARγ正義：5′-CCAGAAAG CGATTCCTTCAC-3′，反義：5′-CACGTTAGTTTCACCTCGGA-3′；C/EBPα正義：5′-AAGAAGTCGGTGGACAAGAACAG-3′，反義：5′-TGCGCACCGCGATGT-3′。按RT-PCR Kit說明書操作。反應條件：(1)37℃逆轉錄30 min；(2)94℃滅活RNA酶2 min；(3)94℃解鏈30 s；(4)55℃退火30 s；(5)72℃延伸45 s；(6)第(3)～(5)步再重復30次；(7)72℃延伸7 min。

1.2.5甲基化特異性 PCR(MSP)法檢測相關基因甲基化狀態按照試劑盒說明提取各組細胞DNA，加入亞硫酸鹽混合液修飾，純化，PCR反應。甲基化引物由Methyl Primer Express v1.0設計，由華大基因合成，引物序列：PPARγ-甲基化(M)正義：TTGGAAAGTCGTATTTTGATAGGAC，反義：CGAACCAAATTACTTAAACGATCAC；PPARγ-非甲基化(NM)正義：GGTTGGAAAGTTGTATTTTGATAGGAT，反義：CAAACCAAATTACTTAAACAATCACCA；C/EBPα-M正義：TTAAAGGAGGGGCGTTTAATTAC，反義：CCACTAACTCCTACGCTACTAAACG；C/EBPα-NM

正義：TTTAAAGGAGGGGTGTTTAATTAT，反義：CCCACTAACTCCTACACTACTAAACA。PCR產物電泳條件：TBE緩沖液，1.2%的瓊脂糖，電壓180 V，電泳時間50 min。用天能GIS1600凝膠成像系統分析凈光密度，求甲基化率〔M光密度/(M光密度+NM光密度)〕。

1.3統計方法應用SPSS19.0軟件，計量資料用單因素方差分析或非參數方法檢驗。兩樣本率的比較用χ2檢驗。

2結果

RT-PCR檢測發現，右歸丸組的PPARγ和C/EBPα表達明顯高于其他各組(P<0.05)。干預14d后，甲基化電泳顯示，右歸丸組甲基化率低于其他各組(P<0.05)。見表1，圖1，圖2。

組別基因表達PPARγC/EBPα基因甲基化率PPARγC/EBPα對照組1.00±0.451.00±0.5518.6610.97成脂誘導組0.92±0.272.80±0.2125.0917.09右歸丸組0.56±0.231)0.63±0.361)34.501)18.661)

與對照組比較：1)P<0.05

圖1　PPARγ甲基化電泳圖

圖2　C/EBPα甲基化電泳圖

3討論

“腎主骨”、“腎生骨髓”見于《素問·宣明五氣篇》。其病理、生理含義為：腎中精氣充盈，則骨髓生化有源，骨才能得到骨髓更好的滋養，骨骼才會強健有力。腎氣衰微，腎精虛少，骨髓化生乏源，不能營養骨骼，則骨髓空虛，發為骨痿。骨質疏松屬于骨痿范疇。

現代醫學研究顯示〔4,5〕，骨質疏松患者BMSCs的成骨分化能力明顯下調，成脂分化方向的能力明顯增強。BMSCs分化失衡，偏向成脂方向分化，所以產生了骨形成的減少與骨髓中脂肪組織的增加，這是骨質疏松、骨壞死等疾病的主要形成原因之一，也與中醫骨痿的病理機制——“骨髓空虛”有著某種意義上的契合。如何降低BMSCs成脂分化過程中相關基因表達將開辟骨質疏松等代謝性骨疾病新的思路。干細胞具有先天之精的屬性，腎所藏之精可相應于胚胎干細胞以及其他成體干細胞(如：骨髓間充質干細胞等)〔6〕。中醫在“腎藏精” 理論指導下的補腎藥物能否調控骨髓間充質干細胞的成脂分化正是本研究的主旨所在。右歸丸出自張景岳的《景岳全書·新方八陣》，為補腎填精的名方。具有溫補腎陽，填精補髓之功效。故本研究選擇右歸丸作為補腎法的研究切入點。

表觀遺傳機制在干細胞定向分化中起著重要的作用。其中，DNA甲基化是基因轉錄水平表觀遺傳學調控的主要方式，其在干細胞分化過程中起著重要的作用。DNA甲基化等表觀遺傳修飾是一種不涉及序列改變的基因表達調控方式，指DNA在甲基轉移酶的催化下，DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶。甲基化達到一定程度時會DNA結構收縮，螺旋加深，而不利于轉錄的起始，導致基因失活。相反地，去甲基化則可上調基因表達。

PPARγ通過調節相關基因的表達，在脂肪形成、糖脂代謝，以及在免疫系統中發揮重要作用，是脂肪細胞分化過程中的關鍵因子〔7〕。C/EBPα也是干細胞向脂肪細胞分化過程中起重要作用的轉錄因子之一。脂肪細胞特異性表達基因調控區內的增強子CCAAT重復序列的位點突變后，這些基因的調控區就不能誘導成脂相關基因的表達。而抑制C/EBPα的表達則可激活Wnt/β-Catenin信號通路刺激成骨相關轉錄因子而促進成骨〔8〕。本研究有效證明了補腎中藥具有抑制BMSCs脂向轉化的功能。PPARγ和C/EBPα甲基化上調，右歸丸組優于其他各組，其甲基化的水平直接影響著成脂化的發展變化。本實驗研究結果表明補腎中藥右歸丸含藥血清可以明顯增高PPARγ和C/EBPα基因甲基化的水平。

綜上所述，右歸丸干預BMSCs成脂過程中PPARγ和C/EBPα基因表達明顯下調，且其DNA甲基化水平增高。一定程度上說明補腎中藥右歸丸可以通過上調成脂基因甲基化率，抑制基因的表達，逆轉骨髓間充質干細胞向成脂方向分化，從抑制骨髓脂肪化來達到治療骨質疏松的目的，為中醫“腎主骨、生髓”理論的深入研究探索了新的思路。

參考文獻4

1Riddihough G，Zahn LM.Epigenetics.What is epigenetics? Introduction〔J〕.Science，2010；330(6004)：611.

2Bibikova M，Laurent LC，Ren B，etal.Unraveling epigenetic regulation in embryonic stem cells〔J〕.Cell Stem Cell，2008；2(2)：123-34.

3Thomas D，Kansara M.Epigenetic modifications in osteogenic differentiation and transformation〔J〕.J Cell Biochem,2006;98(4):757-69.

4Fan QM，Tang TT，Zhang XL.The role ofCCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)α in osteogenesis of C3H10T1/2 cells induced by BMP-2〔J〕.J Cell Mol Med,2009；13(8B)：2489-505.

5Fux C，Mitta B，Kramer BP，etal.Dual regulated expression of C/EBP-alpha and BMP-2 enables differential differentiation of C2C12 cells into adipocytes and osteoblasts〔J〕.Nucleic Acids Res,2004；32(1)：e1.

6何麗娟，宋囡，何文智，等.左、右歸丸通過TGF-β1信號途徑對大鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導的影響〔J〕.中國老年學雜志，2014;34(11)：6382-4.

7張昭亮.C/EBPα基因啟動子DNA超甲基化對與PPARγ相關的HDAC1抑制解除作用〔J〕.中國矯形外科雜志，2013；21(17)：1761-6.

8Sakura A，Komaki M，Rudnicki M.Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic，osteogenic，and adipogenic differentiation〔J〕.Differentiation，2001；68(4-5)：245-53.

〔2015-01-30修回〕

(編輯袁左鳴)

Effect of Yougui Pill(YGP)on gene methylation related adipogenesis differentiation of mysenchymal stem cells

YANG Feng,PAN Le,MA Qiu-Tao,etal.

The Affiliated Hospital of Shaanxi University of TCM,Xi'an 712083,Shaanxi,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of serum contained Yougui pill for adipogenic marker and methylation.MethodsUnder aseptic condition,bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from the femur and tibia of SD rats.The second generation of adherent cells were divided into normal control,bone induction,Yougui pill groups.PPARγand C/EBPα gene expressions and methylation status were measured by RT-PCR and methylation specific PCR assay after 1 days.ResultsPPARγand C/EBPαmRNA expressions of Yougui pill group were obviously lower than those of other groups(P<0.05).The methylations of PPARγand C/EBPαwere up-regulated(P<0.05).ConclusionsThe serum containing Yougui pills could inhibit adipogensis differentiating of bone marrow mesenchymal stem cells by demethylation mechanism.

【Key words】Kidney tonic formula;Yougui pill;BMSCs;Adipogenesis;Methylation

基金項目：國家自然科學基金項目(81102610，81473711)；陜西省中醫管理局科研課題(13-JC014)；陜西省科技研究發展計劃(2015SF072)

中圖分類號〔〕R2-03〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-6979-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.006