電針對非酒精性脂肪肝大鼠細胞角蛋白18表達的影響

蔣　娟　黃學寬　朱　丹　曾志華　駱　言　張超男

(重慶醫科大學中醫藥學院，重慶　401331)

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電針對非酒精性脂肪肝大鼠細胞角蛋白18表達的影響

蔣娟黃學寬朱丹曾志華駱言張超男

(重慶醫科大學中醫藥學院，重慶401331)

摘要〔〕目的觀察電針對非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠細胞角蛋白18(CK18)變化的調節規律，探究其作用機制。方法取SD大鼠44只，雌性，體質量(180±20)g，將大鼠隨機分為正常組、模型組、東寶肝泰組、電針組，每組11只。正常組食用標準飼料，其余各組均采用高脂高膽固醇(TC)飼料(含2%膽固醇、10%豬油及88%基礎飼料)喂養8 w。造模成功后，東寶肝泰組按0.9 g/kg體重灌服，1次/d，共治療28 d；電針組針刺 “肝俞”、“脾俞”、“膈俞”穴，電壓9 V，電流強度1～3 mA，頻率為1.5～2 Hz，疏密波，留針15 min，1次/d，連續28 d。應用酶聯免疫吸附法(ELISA)、免疫組化法分別檢測各組大鼠血清及肝組織CK18的變化。結果ELISA和免疫組化結果顯示，與正常組比較，模型組CK18含量與表達均上調(P<0.05)，電針組與東寶肝泰組CK18含量與表達均較模型組下調(P<0.05)，且電針組明顯優于東寶肝泰組(P<0.05)。結論電針干預可顯著抑制NAFCD模型大鼠CK18含量和表達的上調趨勢，對緩解NAFLD肝細胞進一步發展，減輕肝臟負荷具有重要作用。

關鍵詞〔〕電針；非酒精性脂肪肝；細胞角蛋白18

第一作者：蔣娟(1987-)，女，2011級在讀碩士，主要從事針灸理論及臨床研究。

非酒精性脂肪肝(NAFLD) 是一種無過量飲酒史，以肝實質細胞脂肪性變和脂肪存積為特征的臨床病理綜合征，其發病機制至今尚未完全明確。因脂肪肝可使肝細胞壞死，進一步演變為肝纖維化、肝硬化，故早期診治以防止其發展至關重要。而細胞角蛋白(CK)18作為一種從凋亡肝細胞中釋放出來的蛋白，與肝臟損傷關系十分密切。本實驗檢測電針對NAFLD大鼠CK18含量及表達的影響，探討電針治療NAFLD的作用機制。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器總膽固醇(TC)(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號：13K10350)；東寶肝泰(通化東寶藥業股份有限公司，國藥準字H22024764，批號：20120411)；CK18酶聯免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20121009)；CK18抗體(北京博奧森生物技術公司，批號：20121203)；電針綜合治療儀(重慶醫療器械廠制造)；80-2型低速離心機(上海手術器械廠)；酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS 352型)；洗板機(芬蘭Thermo Labsystems AC8)；顯微鏡(日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11)；多功能真彩色細胞圖像分析處理系統(美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus)；恒溫水浴箱(江蘇太倉醫用儀器廠DSHZ-300型)等。

1.2實驗分組與模型復制清潔級雌性SD大鼠44只，體質量(180±20)g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供(動物批號：SCXK渝2007-0001)，大鼠自由攝食和飲水，適應性喂養1 w后，隨機分為正常組11只和模型組、東寶肝泰組和電針組，每組11只，正常組食用標準飼料，造模大鼠以高脂高TC飼料〔1〕(即含2%膽固醇、10%豬油及88%基飼飼料)制造NAFLD模型，喂養8 w。造模第8周末，隨機抽取正常組大鼠1只和造模大鼠3只(分別從模型組、東寶肝泰組和電針組各抽取1只)，處死，取肝臟進行病理切片證實脂肪肝已形成，說明造模成功。

1.3治療方法東寶肝泰組：大鼠灌胃東寶肝泰溶液，按0.9 g/kg體重灌服，1次/d，連續28 d。電針組：以調肝健脾、化痰活血為法，電針時將大鼠放置于大鼠固定器中，大鼠腧穴根據《實驗針灸學》定位〔2〕，取雙側肝俞、脾俞、膈俞，用32#毫針，分別刺入1～7 mm深度，接通電針綜合治療儀，頻率為電壓9 V，電流強度1～3 mA，1.5～2 Hz，疏密波，以大鼠軀干輕微抖動為度，保持大鼠狀態清醒，1次/d，每次15 min，連續治療28 d。正常組和模型組每天放入大鼠固定器中15 min，不作其他處理，共28 d。

1.4指標檢測在末次治療后禁食24 h，摘取大鼠眼球取血，靜置30 min，低溫離心機3 000 r/min離心15 min，取上清液，4℃保存待測。頸椎脫臼處死大鼠，及時打開腹腔，取肝臟左葉相同部位大小肝組織放入10%甲醛中固定，石蠟包埋，切片，染色，光學顯微鏡下拍照。CK18酶聯免疫吸附法(ELLSA)檢測血清，按照試劑盒說明進行操作；CK18免疫組化法檢測肝組織，按照SP試劑盒操作，每張切片最少10個高倍視野，光鏡400倍下觀察。應用多功能真彩色細胞圖像分析處理系統對CK18的蛋白表達進行分析，胞質棕褐色為陽性反應，用陽性細胞面積來標示表達強度。

1.5統計學處理采用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1大鼠血清CK18含量的比較與正常組(227 pl)比較，模型組大鼠血清CK18的含量顯著升高(588 pl，P<0.05)；與模型組比較，東寶肝泰組和電針組血清CK18的含量顯著降低(410 pl,P<0.05)；但電針組(309 pl)對NAFLD模型大鼠血清CK18含量的影響明顯優于東寶肝泰組(P<0.05)。

2.2大鼠肝組織免疫組化法CK18表達的比較CK18免疫組化顯示陽性細胞為棕黃色顆粒，在高倍顯微鏡下觀察每個視野內陽性細胞率，并對圖片陽性區域進行累積光密度值(IOD)測定。結果發現，模型組IOD值顯著高于正常組(P<0.05)，為強陽性表達；電針組和東寶肝泰組IOD值顯著低于模型組(P<0.05)，且電針組IOD值低于東寶肝泰組(P<0.05)，可見電針組為弱陽性表達，東寶肝泰組為陽性表達。見表1、圖1。

組別陽性細胞率(%)陽性細胞顯示強度IOD正常組0.711.2±0.31)模型組533171.5±15.5東寶肝泰組26369.3±6.21)2)電針組10131.5±4.91)

與模型組比較：1)P<0.05；與電針組比較：2)P<0.05

圖1　大鼠肝組織免疫組化法CK18的表達(SP法，×400)

3討論

NAFLD發生的主要原因是脂類代謝障礙，其發病機制較為復雜，至今尚未完全闡明。本病在脂肪變性的基礎上常伴有肝細胞變性壞死和炎癥細胞浸潤，而炎癥應答主要在脂肪組織和肝臟中存在〔3〕，可見小葉內炎癥、匯管區炎癥、匯管區變性及點狀壞死或壞死灶。目前NAFLD的發生和發展可用“兩次打擊”的理論解釋〔4〕，NAFLD因為肝內脂類代謝不平衡引起的胰島素抵抗(IR)而導致第1次打擊。IR完成后，其受體通過自身磷酸化激活下游的(MAPK)通路和其相關核內轉錄因子，使炎癥因子和活性氧自由基得以釋放，炎癥因子反應過多，造成第二次打擊，從而加重NAFLD〔5〕。

CK18 是肝細胞膜骨架重要的組成部分，主要表達于成熟上皮細胞的中間絲蛋(IFP)。CK18主要保護肝細胞不受到機械性和非機械性導致的各種壓力，一般認為CK18是肝細胞凋亡和壞死過程中的一種相對特異蛋白，可在肝臟受到損害時起到“監察”作用〔6〕，從而防止肝臟受到進一步損害。CK18在肝病領域的意義主要在于識別輕微的肝臟損傷，轉氨酶甚至在正常范圍內的輕微肝損。研究表明，通過ELISA法檢測血清中CK18水平能較準確地反映肝臟病理變化〔7〕。可見電針能調節NAFLD模型大鼠血清CK18含量和肝組織CK18的表達，也是研究NAFLD的新思路和新方法。

有文獻發現雌性大鼠比雄性大鼠更容易受到NAFLD的損傷，故選擇雌性大鼠作為本實驗的研究對象〔8〕。而針灸是通過整體調節和雙向調節作用，以達到扶正祛邪、疏通經絡以協調陰陽之目的。有研究對150例NAFLD肝患者進行多因素Logistic回歸分析，發現體重指數(BMI)、TG、空腹血糖(FBG)、(DBP)是NAFLD的獨立危險因素，認為NAFLD以肝氣郁滯型、濕熱內蘊型、痰濕內阻型、瘀血阻滯型、肝腎陰虛型五種癥候為主，其主要獨立危險因素為BMI、TG、FBG、DBP〔9〕。而應用肝脾相關理論治療NAFLD肝纖維化以提高臨床療效，認為其作用機制之一可能與通過調節瘦素、脂質代謝功能有關〔10〕。也有人認為，痰瘀阻絡是NAFLD形成的基本病機〔11〕。因此，痰瘀互結、肝脾失調應是NAFLD形成的主要原因，通過針刺則可調節炎癥因子的表達以促進脂代謝〔12〕。本實驗通過電針“肝俞”、“脾俞”、“膈俞”而達到消痰化瘀、健脾疏肝等作用。其中肝俞穴具有行氣疏肝的功效，《素問》“從陰引陽，從陽引陰”，因臟病為陰病，背俞穴位于陽位，采用俞治臟病；脾俞健脾化濕，可增強胃腸蠕動，并能提高多種消化酶的活力，幫助消化以降低血脂、血液黏度；膈俞具有寬胸理氣、活血通絡的作用，能降低血液黏滯度，使血流加速，改善微循環。

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〔2014-06-11修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：黃學寬(1972-)，男，教授，碩士生導師，主要從事中醫經絡理論及臨床研究。

基金項目：重慶市衛生局科技資助項目(2011-2-146)

中圖分類號〔〕R575.5〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6708-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.027