高果糖、高脂喂養致小鼠肝臟內質網應激的時程變化

任路平　于　賢　宋光耀　孫　文　李　凡　陳樹春

(河北省人民醫院內分泌一科，河北　石家莊　050000)

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高果糖、高脂喂養致小鼠肝臟內質網應激的時程變化

任路平于賢宋光耀孫文李凡陳樹春

(河北省人民醫院內分泌一科，河北石家莊050000)

摘要〔〕目的探討高果糖與高脂飲食對比誘導的小鼠肝臟內質網應激(ERS)的發生時程變化。方法雄性C57BL/J6小鼠分為對照組、高果糖組及高脂組，分別在喂養3 d、8 w后測定各組小鼠空腹血糖(FPG)、空腹血清胰島素(FINS)、肝臟甘油三酯(TG)含量，并測定各組小鼠肝臟ERS標志物——磷酸化胰腺內質網激酶(p-PERK)及磷酸化山梨醇要求激酶-1(p-IRE1/t-IRE1)的蛋白表達。結果喂養3 d后，與對照組相比，兩組FPG、FINS無明顯變化，而肝TG水平均顯著增加；喂養8 w后，與對照組相比，兩組FPG、FINS、肝TG水平均顯著增加；喂養3 d后，與對照組相比，高果糖組的肝內p-PERK、p-IRE1蛋白表達顯著增加，提示出現ERS，而高脂組GRP78、p-PERK的蛋白表達與對照組無顯著區別；喂養8 w后，高果糖、高脂組的肝內p-PERK、p-IRE1蛋白表達均顯著增加。結論短期和長期高果糖和高脂喂養均可引起肝內脂質沉積，但高果糖喂養小鼠在脂肪肝發生早期即可出現肝ERS，而高脂喂養小鼠則在長期喂養后方出現肝ERS，提示ERS與高果糖、高脂飲食誘導的脂肪肝發生發展均有關，但介導機制不同。

關鍵詞〔〕甘油三酯；脂肪肝；內質網應激

第一作者：任路平(1977-)，女，副主任醫師，碩士生導師，主要從事內分泌脂代謝學研究。

果糖和脂類是引起肝內脂肪沉積的兩個重要的飲食因素，嚙齒類的動物實驗發現，不同時期的果糖、脂類的過量攝入(短期及長期喂養)均可引起肝內甘油三酯(TG)等脂質沉積〔1,2〕。研究表明，肝臟內質網應激(ERS)可能參與了脂肪肝的發生發展〔3〕。然而，尚無研究比較兩種不同飲食因素誘導脂肪肝的發生時期與ERS的關系。本研究旨在進一步探討ERS在飲食誘導脂肪肝中的介導作用。

1材料和方法

1.1模型建立成年雄性C57BL/J6小鼠按隨機數字表隨機分為對照組、高果糖組及高脂組，每組30只，體重24～27 g。對照組進食普通飼料(淀粉69%，脂肪10%，蛋白質21%)；高果糖組飼料配方：淀粉34.5%，果糖34.5%，脂肪9%，蛋白質21%；高脂組飼料配方：淀粉20%，脂肪59%，蛋白質21%。三組小鼠每日進食熱量基本相等，于喂養3 d后行相關指標測定，并每組處死15只小鼠，留取肝臟組織；余小鼠繼續喂養至8 w后行相關指標測定，處死小鼠，留取肝臟組織。

1.2檢測指標及方法

1.2.1血清指標測定各組小鼠于不同時期自尾尖取血，分離血清，空腹血糖(FPG)采用快速血糖測定儀測定；空腹血清胰島素(FINS)采用放射免疫法測定。

1.2.2肝臟TG測定取肝臟組織20～30 mg，經氯仿/甲醇抽提TG后，應用TG檢驗測試試劑盒(GPO-PAP)測定TG含量。

1.2.3Western印跡法測定蛋白含量每組隨機選6例樣本進行蛋白表達分析。取肝組織30 mg加入RIPA 裂解液制成勻漿，用低溫離心機13 000 r/min離心5 min，取20 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉移至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉后加入1∶1 000稀釋的抗體，單抗4℃孵育過夜；加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，增強化學發光法(ECL)Plus 發光顯色，X線底片壓片、顯像。內參抗體Pan14-3-3。用IMAGEJ軟件分析目的蛋白表達相對含量。磷酸化胰腺內質網激酶(p-PERK)抗體由cell signaling公司提供(#3191)，磷酸化山梨醇要求激酶-1(p-IRE-1)抗體、總IRE-1抗體、Pan14-3-3由ABCAM公司提供(ab48187，ab48189，ab12341)。

1.3統計學方法應用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1實驗3 d、8 w后各組小鼠指標檢測結果各組小鼠實驗起始體重無差異，喂養3 d后，不同飼料體重增長無明顯區別，高果糖組、高脂組的FBG、FINS與對照組比較無差異(P>0.05)，喂養8 w后，各組小鼠體重增長無明顯區別，但高果糖組、高脂組的FBG、FINS均顯著高于對照組，高果糖組、 高脂組之間無顯著區別。實驗3 d、8 w后，與對照組相比，高果糖組、高脂組的肝臟TG水平均顯著增高(P均<0.01)，其中高果糖組高于高脂組(P<0.01)。見表1。

組別體重(g)FPG(mmol/L)FINS(nmol/L)肝臟TG(μmol/g)3d對照組25.1±0.45.9±0.30.18±0.0410.65±0.54 高果糖組25.4±0.66.1±0.50.19±0.0326.28±0.671 高脂組 25.3±0.76.0±0.40.19±0.0524.69±0.991)2)組別體重(g)FPG(mmol/L)FINS(nmol/L)肝臟TG(μmol/g)8w對照組28.9±0.66.4±0.40.23±0.0713.72±0.67 高果糖組29.1±0.87.6±0.41)0.38±0.041)30.82±1.761) 高脂組 29.2±0.97.5±0.51)0.35±0.061)29.56±1.531)

與對照組比較：1)P<0.01;與高果糖組比較：2)P<0.05

2.2各組肝臟ERS標志物表達情況喂養3 d后，與對照組相比，高果糖組反映ERS的p-PERK、p-IRE1/t-IRE1蛋白表達明顯增加(P均<0.01)，而高脂組與對照組無顯著差別(P均>0.05)(圖1)。喂養8 w后，與對照組相比，高果糖組、高脂組的p-PERK、p-IRE1/t-IRE1的蛋白表達均明顯增加(P<0.01)(圖2)。

圖1　喂養3 d后各組肝臟ERS標志物表達情況

圖2　喂養8 w后各組肝臟ERS標志物表達情況

3討論

關于飲食攝取的流行病學研究表明，脂類和果糖的過量攝入與非酒精性脂肪肝的發生發展相關〔4,5〕。既往研究表明，短期(喂養3 d或1 w)的脂類、果糖過量攝入即可引起肝細胞內脂質沉積〔1,6〕，本研究結果和既往研究結果一致，高果糖、高脂喂養3 d后即出現肝細胞內TG含量升高；同時，在喂養8 w后，高果糖、高脂飲食喂養小鼠均存在持續的肝臟脂質沉積。通過短期、長期的兩種飲食喂養，本研究證實了果糖、脂類的過量攝入對肝細胞脂質代謝的危害。

肝細胞具有多種合成代謝的功能，而內質網是多功能的細胞器，特別是在肝細胞內，內質網負責合成脂類，也加工各種蛋白包括脂肪合成酶類，對能量代謝的變化很敏感。近年，ERS在肝臟疾病發生發展中的作用被認識到。不同角度的研究發現，ERS與脂肪肝的發生發展有密切關系。以往研究發現，在ob/ob小鼠(遺傳性肥胖)和長期高脂喂養的嚙齒類動物模型中，隨著脂肪肝的出現，亦伴有肝內ERS〔3〕；而4-苯基丁酸(4-PBA)可通過抑制ERS減輕ob/ob小鼠內的肝臟TG含量〔7〕。前期研究也發現長期高果糖喂養可在誘導小鼠脂肪肝的同時誘導肝臟出現ERS〔2〕。但是，目前尚無研究比較不同時期高果糖、高脂飲食誘導脂肪肝中ERS的時程變化。本研究結果提示，ERS貫穿了高果糖飲食誘導的脂肪肝的發生發展的始終，而僅僅出現在高脂喂養誘導的肝臟脂質合成的后期。這種不一致的時程變化提示ERS在兩種飲食介導的脂肪肝中可能發揮著不同的介導作用。內質網具有復雜的功能，分子學研究表明，ERS不僅可通過刺激脂質合成促進肝臟脂質堆積及脂肪肝的早期發生，同時可參與脂肪肝發展后期的氧化應激、細胞凋亡等事件〔3〕。ERS在兩種飲食中的不同時程改變可能與果糖、脂類通過不同機制誘導肝細胞脂質沉積有關。首先，果糖作為一個強烈的刺激肝臟脂質從頭合成的飲食因子，可促進脂質合成上游因子(如SREBP-1，ChREBP等)的上調，繼而促進脂質合成關鍵酶的表達增加，引起內源性脂質合成增多而致肝細胞內TG等脂質堆積。本課題組前期研究表明，3 d及8 w果糖過量攝入后，嚙齒類動物肝臟內的脂質合成相關酶類，包括乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰CoA脫飽和酶(SCD)-1和脂肪酸合成酶(FAS)的蛋白表達均顯著上調〔2,6〕，提示脂質從頭合成增強是短期、長期高果糖喂養引起脂肪肝的重要機制之一。不同的分子生物學研究表明，ERS中的非折疊蛋白反應(UPR)通路可刺激脂質從頭合成，目前認為UPR的PERK-eIF2α和IRE-1-XBP-1通路介導了的脂質從頭合成。一個轉基因小鼠模型通過減少eIF2α的磷酸化抑制了PERK-eIF2α通路的激活，發現PERK-eIF2α通路的抑制可減輕高脂飲食誘導的小鼠肝內脂質沉積，揭示了此條UPR通路具有調節肝臟脂質合成的作用〔8〕；一個XBP-1基因敲除小鼠模型的研究發現，XBP-1基因可調控SCD-1和ACC2的表達，從而影響了脂質代謝，XBP-1基因實際上是調控肝臟脂質從頭合成的一個新的上游轉錄因子〔9〕；另外，在ob/ob小鼠中，ERS伴侶分子GRP78的過表達可促進脂質合成上游轉錄因子SREBP-1c的活化，從而促進SREBP-1c靶基因表達的上調〔10〕。這些研究均提示ERS通過影響肝臟內源性的脂質合成而介導了脂肪肝的發生。高果糖喂養3 d后，小鼠肝內ERS可能通過刺激肝內脂質從頭合成參與了果糖誘導脂肪肝的始動發生環節。

與此相反，高脂喂養通過不同的機制引起脂肪肝。由于高脂飲食(棕櫚酸為主要成分)中提供了機體需要量以外的過多的外源性脂質，流入肝臟的外源性飽和脂肪酸增多，刺激了甘油磷酸脂酰轉移酶(GPAT)活化，GPAT的活化進一步使TG和脂蛋白的合成增加，導致了肝細胞內脂質的沉積而引起脂肪肝〔11〕。既往研究表明，與高果糖喂養相反，高脂喂養小鼠肝細胞內ACC、FAS和SCD-1的蛋白表達均下調，原因是過多的外源性脂肪酸抑制了肝內源性脂質從頭合成通路〔1,2〕。因此，這可能解釋了本研究中ERS未出現于短期高脂喂養小鼠脂肪肝的原因，提示在高脂喂養小鼠中，肝臟脂質沉積早于ERS的出現，ERS并未介導高脂飲食誘導的脂肪肝的早期發生。同時，本研究結果表明，長期高脂喂養后小鼠肝內出現了ERS，支持了ERS在高脂喂養脂肪肝后期發展中的介導作用。在脂肪肝持續存在的過程中，肝細胞內過量的脂質負荷活化了ERS，引起了UPR，持久的UPR及持續的ERS則會誘導細胞凋亡、組織炎癥及壞死，參與了脂肪肝的后期發展〔12〕。

ERS在果糖、脂類所誘導的脂肪肝中發揮了不同的作用。兩種不同飲食因子在不同時期誘發了肝臟ERS，ERS介導了果糖過量攝入所誘導的脂肪肝早期的發生發展，ERS可能是果糖誘導脂肪肝的始動因素之一；而ERS不是高脂飲食誘導的脂肪肝的早期細胞事件，而發生于肝脂質合成發生后期，提示ERS并不是脂類誘導脂肪肝的始動因素，而可能參與了脂肪肝后期所出現炎癥、氧化應激等細胞事件；具體機制還需進一步深入的分子生物學研究。

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〔2014-11-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：宋光耀(1958-)，男，主任醫師，博士生導師，主要從事內分泌脂代謝學研究。

基金項目：國家自然基金資助項目(No.81200639)

中圖分類號〔〕R333.4〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6694-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.020