獼猴B病毒囊膜蛋白gD基因真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

王　新，易思萌,，劉慧芳,，馬　凱，范君文，馬雨楠，游　穎，孫兆增

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島　266109； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京　100071)

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獼猴B病毒囊膜蛋白gD基因真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

王新1，易思萌1,2，劉慧芳1,2，馬凱1，范君文2，馬雨楠2，游穎2，孫兆增2

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島266109； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京100071)

【摘要】目的構(gòu)建獼猴B病毒囊膜蛋白gD的真核表達(dá)載體，并且檢測(cè)其在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。 方法 首先通過(guò)基因合成手段獲得含B病毒gD蛋白的基因片段，在經(jīng)由PstⅠ和NotⅠ雙酶切后連接到pEGFP-N3載體，隨后將構(gòu)建的pEGFP-N3-GD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人胚胎腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞。再用Western blot檢測(cè)所提蛋白其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，并用激光共聚焦分析其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位情況。 結(jié)果 成功獲得攜帶gD基因的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pEGFP-N3-GD，且pEGFP-N3-GD重組質(zhì)粒能在293T細(xì)胞的表面正常表達(dá)。 結(jié)論 利用真核表達(dá)系統(tǒng)，既能夠在細(xì)胞表面產(chǎn)生B病毒gD蛋白的特異性重組抗原，而且可用于B檢測(cè)抗原的制備。

【關(guān)鍵詞】獼猴B病毒；gD蛋白；載體構(gòu)建；真核表達(dá)

Construction of eukaryotic vector of monkey B virus

猴B病毒，也叫猴皰疹病毒I型(cercopithecine herpesvirus I)，α-皰疹病毒亞科，單純皰疹病毒屬。和它同一種屬的還有會(huì)引起人口腔潰瘍的單純皰疹病毒1型病毒(herpes simplex type 1, HSV-1)和人生殖器皰疹病毒HSV-2[1-3]。B病毒主要自然宿主是獼猴等靈長(zhǎng)類動(dòng)物，感染率極高，它可使恒河猴引起一過(guò)性的皰疹樣口炎，于7～14 d內(nèi)自愈，但卻能使人類等非自然宿主動(dòng)物出現(xiàn)致死性的腦炎或上行性腦脊髓炎(死亡率超過(guò)70%)[1-3]，正是由于其對(duì)人生命安全的高度威脅性，而被歸于生物安全4級(jí)病原。在B病毒的快速檢測(cè)方面，國(guó)內(nèi)目前主要使用的檢測(cè)抗原是HSV-1 和 HSV-2，而國(guó)外主要使用的檢測(cè)抗原是SA8 和 HVP-2 等同源病毒[3，4]，雖然這些病毒抗原具有較高的安全性，但同樣較高的抗原交叉性致使B病毒的檢測(cè)誤差可達(dá)3%～10%。同樣在B病毒的有效防治方面，受制于檢測(cè)抗原的影響，對(duì)其防治辦法的深入研究與防治效果的追蹤反饋也相應(yīng)的遇到了瓶頸。因此，找尋安全高效的特異性抗原對(duì)于研究獼猴B病毒的有效防治與快速診斷十分重要。

蛋白gB、gC、gD和gG等，均屬于B病毒不同類型的囊膜蛋白，不同類型的囊膜蛋白在B病毒的復(fù)制傳播中所起到的作用也各有不同。囊膜gD蛋白，它主要負(fù)責(zé)參與獼猴B病毒的吸附、膜融合和入侵；同時(shí)又與病毒的傳播以及逃避機(jī)體免疫監(jiān)視有著密切的關(guān)系。這些糖蛋白是獼猴B病毒檢測(cè)的主要候選抗原，其中囊膜蛋白gB，其敏感性最高(99%)，但特異性最低。gG重組蛋白的檢測(cè)特異性最好(97.5%)，但敏感性只有80%[5]； 而重組蛋白gD的檢測(cè)敏感性較gG要高，且特異性較較gB要好，因此，gD重組蛋白是獼猴B病毒診斷的有效抗原。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-N3-gD(含gD基因片段)，并將其轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，確認(rèn)gD重組蛋白可在293T細(xì)胞的表達(dá)，為進(jìn)一步研究gD蛋白對(duì)獼猴B病毒生物學(xué)功能的影響，以及將重組蛋白gD作為獼猴B病毒快速診斷用特異性抗原的研究提供相應(yīng)的支持。

1材料和方法

1.1材料

獼猴B病毒gD胞外區(qū)基因序列由博邁德合成，DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒回收試劑盒、膠回收試劑盒、DNA marker 2000、DNA marker 10000、2× Taqmix購(gòu)自北京博邁德生物公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自 Invitrogen 公司。細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自 Hyclone 公司。Myc標(biāo)簽一抗購(gòu)自AB-mart公司。T4連接酶、限制性內(nèi)切酶PstⅠ和NotⅠ等，來(lái)自 Takara公司。山羊抗小鼠IgG(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)，采購(gòu)自中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1gD基因合成：gD為糖蛋白的一種，具有明顯糖蛋白的特質(zhì)，基因序列由胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)組成。根據(jù)其基因序列，合成基因片段，長(zhǎng)度約為1 304 bp，主要包括gD蛋白的胞外區(qū)域。并在基因的5`端引入了MHC I類分子的信號(hào)肽序列和PstI酶切位點(diǎn)，在基因3`端引入myc標(biāo)簽序列和NotI酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)完成后，由北京博邁德生物有限公司負(fù)責(zé)合成。

1.2.2pEGFP-N3-gD重組質(zhì)粒的構(gòu)建：用PstI和NotI將之前測(cè)序篩選過(guò)的gD基因片段進(jìn)行雙酶切，所產(chǎn)生的基因回收產(chǎn)物利用與T4連接酶pEGFP-N3質(zhì)粒相連接。 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那抗性的平板進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，并進(jìn)一步使用PCR的方法篩選出陽(yáng)性克隆，最終選出的PCR陽(yáng)性質(zhì)粒再利用酶切的方法進(jìn)一步鑒定。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染：在DMEM培養(yǎng)基中(內(nèi)含10%的胎牛血清)培養(yǎng)的293T細(xì)胞，并傳代至6孔培養(yǎng)板。在培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)到70%~80%時(shí)(在6孔板中)，再用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。然后將這些細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d或2 d后，收集這些細(xì)胞進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.4Western blot 免疫印跡實(shí)驗(yàn)：用細(xì)胞核—胞漿—胞膜制備試劑盒來(lái)提取蛋白，吸取40 μL總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。用脫脂奶粉(濃度為5%)來(lái)封閉PVDF膜，在兩個(gè)小時(shí)以后加入Myc一抗(1∶5 000)；置于4℃搖床上，孵育12 h，充分洗滌后，再加入山羊抗鼠的二抗(1∶8 000)，在室溫下培養(yǎng)1 h，TBST緩沖液洗滌3次，然后加入發(fā)光顯色劑，再置于暗室用X光進(jìn)行曝光、顯影。利用β-actin蛋白作為對(duì)照。

1.2.5細(xì)胞表達(dá)定位實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞在繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，對(duì)細(xì)胞的固定一般需要15 min，之后再用0.3% Triton X-100透化處理。以上處理完成后，加入10% BSA封閉，再用myc標(biāo)簽的一抗和FITC熒光的二抗孵育之后，接著用濃度為1 μg/mL的RNase(1ml/孔)消化RNA，最后加入PI，600 μL左右染色10 min。再用適量的抗熒光猝滅封固液，封片固定。之后利用德國(guó)蔡司公司生產(chǎn)的Zeiss Ism 510 Meta 熒光共聚焦成像顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照。

2結(jié)果

2.1基因合成結(jié)果分析

利用PCR法鑒定已合成gD基因，試驗(yàn)結(jié)束后所得的結(jié)果顯示，目的片段的大小與預(yù)期結(jié)果相符，目的片段大小為1 000～2 000 bp之間(圖1)，而預(yù)期結(jié)果大小為1 400 bp左右。并且在測(cè)序后，根據(jù)所得結(jié)果可知，這段經(jīng)PCR鑒定的gD基因與恒河猴gD基因的同源性可達(dá)100%。

圖1　gD基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Note. M：Marker 2000；Fig.1　PCR amplification results of gD protein

2.2 pEGFP-N3-gD重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果分析

利用T4連接酶，將已經(jīng)合成的gD基因定向的連接到pEGFP-N3載體。利用利用PCR方法篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒。并利用雙酶切法的方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖2，表明經(jīng)雙酶切后的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pEGFP-N3-gD，分別在5 000 bp左右和1 000 bp左右切成兩個(gè)片段，由此可知gD成功克隆到pEGFP-N3載體上。

注：M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:重組質(zhì)粒pEGFP-N3-GD的PstⅠ和NotⅠ雙酶切結(jié)果圖2　雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-N3-GDNote. M：DNA molecular standard；1: The products of enzyme digestion with PstⅠand NotⅠFig.2　Enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pEGFP-N3-GD

2.3 pEGFP-N3-gD的Western-Blot鑒定

利用Western-Blot對(duì)pEGFP-N3-gD的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。試驗(yàn)初預(yù)測(cè)pEGFP-N3-gD分子量為45 kDa，而由圖3顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分子量在50 kDa左右。說(shuō)明gD重組蛋白可以在293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確翻譯，并可能進(jìn)行了一定的翻譯后加工修飾。

注：M:低水平蛋白；1-4：pEGFP-N3-gD基因的表達(dá)鑒定結(jié)果。圖3　gD基因表達(dá)的western-blot鑒定Note. M: Low molecular weight protein marker；1-4: Identification of the gD expression.Fig.3　Identification of the expression of gD protein by Western-blotting

2.4 pEGFP-N3-gD在細(xì)胞內(nèi)的定位表達(dá)

利用激光共聚焦顯微鏡觀察gD 基因在293T細(xì)胞的表達(dá)情況，觀察它們轉(zhuǎn)染后的形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，(其重組蛋白)能發(fā)出綠色熒光(在經(jīng)過(guò)FITC標(biāo)記抗體染色)，但是，由PI染色過(guò)的細(xì)胞核發(fā)出的熒光卻為紅色。由圖4(見(jiàn)文后彩插2)可知，pEGFP-N3-gD重組蛋白主要在細(xì)胞膜上進(jìn)行表達(dá)，可能是MHC I類分子(附加在gD蛋白前端)的信號(hào)肽引導(dǎo)gD蛋白在細(xì)胞膜上表達(dá)。

3討論

近年來(lái)，關(guān)于獼猴B病毒gD囊膜蛋白在B病毒的診斷和防治方面的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，gD囊膜蛋白可以作為誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶點(diǎn)之一，國(guó)外的研究者曾經(jīng)以B病毒gD蛋白基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)DNA疫苗；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)能誘導(dǎo)猴產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并對(duì)B病毒有一定的中和保護(hù)作用[6]。另外一個(gè)課題組的研究結(jié)果表明，將gD基因插入到痘苗病毒載體制成核酸疫苗，91%(10/11)被免疫的兔子可抵抗病毒的攻擊[7]。國(guó)內(nèi)學(xué)者肖鏡等探索了利用gB、gC和gD重組蛋白以及gD的肽合成片段進(jìn)行B病毒的檢測(cè)[8]；張文韜等[9]則對(duì)關(guān)于 B病毒囊膜糖蛋白gD基因的克隆及原核表達(dá)進(jìn)行了研究。

真核表達(dá)蛋白可進(jìn)行翻譯后加工，例如糖基化修飾等，并可正確折疊。利用真核系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原，能夠最大程度的模擬病毒蛋白，用于檢測(cè)時(shí)的特異性和靈敏性更高。但真核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量低，獲得重組抗原的數(shù)量較少。本實(shí)驗(yàn)利用真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了gD蛋白，并利用信號(hào)肽設(shè)法讓蛋白在細(xì)胞的表面表達(dá)。蛋白在細(xì)胞的表面表達(dá)，擬不用純化抗原，直接用細(xì)胞制備抗原片，用于病毒血清的檢測(cè)。在下一步的實(shí)驗(yàn)中，會(huì)獲得gD蛋白的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，直接用于病毒檢測(cè)抗原片的制備，為新型獼猴B病毒檢測(cè)方法的建立提供新的方法。

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〔修回日期〕2015-05-07

研究報(bào)告

glycoprotein D gene and the gD gene expression

WANG Xin1, YI Si-meng1,2，LIU Hui-fang1,2, MA Kai2, FAN Jun-wen2, MA Yu-nan2,

YOU Ying2, SUN Zhao-zeng2

(1. Qingdao Agriculture University, Qingdao 266109, China；

2. Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071)

【Abstract】ObjectiveTo establish an eukaryotic vector of monkey B virus glycoprotein D gene and analyze the expression of gD gene in human embryonic kidney 293T cells. MethodFirst, the protein of monkey B virus glycoprotein D was obtained by gene synthesis. The gene fragments were digested with Pst I and Not I, and ligated to pEGPF-N3. Then, the recombinant plasmid pEGPF-N3-GD was transfected into 293T cells. The expression of gD protein in the cells was detected by Western blot, and the expression localization was investigated using laser scanning confocal microscopy. ResultsThe recombinant plasmid pEGPF-N3 carrying gD gene was successfully constructed, and normally expressed in the 293T cells. ConclusionsGlycoprotein D of monkey B virus is expressed successfully in the 293T cells and the protein is located on the cell surface. It may be useful for the preparation of specific recombinant antigen to the glycoprotein D of monkey B virus on cell surface, and can be also used for preparation of antigen slide for detection of monkey B virus.

【Key words】Monkey B virus; gD protein; Vector construction；Eukaryotic expressing

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.006

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 06-0028-04

[通訊作者]孫兆增(1977-)，男，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分子微生物學(xué)，E-mail: laxszz@aliyun.com。

[作者簡(jiǎn)介]王新 (1973- ) 男，副教授，研究方向：中獸醫(yī)學(xué)。

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272387)；十二五重大傳染病專項(xiàng)(2011zx09201-031)。