蒺藜苜蓿全基因組中U-box基因家族的篩選與特征分析

鄭興衛，邵麟惠，李聰

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193)

蒺藜苜蓿全基因組中U-box基因家族的篩選與特征分析

鄭興衛，邵麟惠，李聰*

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193)

摘要：植物基因組中廣泛存在U-box基因，其編碼蛋白大部分作為泛素系統中決定底物特異性識別的E3泛素連接酶，廣泛地調控植物生長生殖發育以及響應逆境脅迫等過程。本文利用蒺藜苜蓿基因組數據庫，通過生物信息學手段，鑒定蒺藜苜蓿U-box家族基因；采用MEGA6軟件進行系統進化樹分析；通過GSDS在線工具和Mapinspect軟件進行基因結構及染色體定位分析；利用已有的蒺藜苜蓿芯片數據進行組織表達和脅迫響應表達分析。結果表明，蒺藜苜蓿基因組中含有41個U-box基因，不均勻地分布于蒺藜苜蓿的8條染色體上。根據結構域組成和系統進化分析將這些U-box蛋白分成6類。基因表達模式分析發現，該家族成員的表達具有一定的組織特異性，并能響應鹽、干旱和氮素脅迫。這些研究結果為蒺藜苜蓿U-box基因家族的功能分析奠定了基礎。

關鍵詞：蒺藜苜蓿；U-box基因家族；進化；表達模式

DOI：10.11686/cyxb2015102http://cyxb.lzu.edu.cn

鄭興衛，邵麟惠，李聰. 蒺藜苜蓿全基因組中U-box基因家族的篩選與特征分析. 草業學報, 2015, 24(8): 130-141.

Zheng X W, Shao L H, Li C. Genome-wide screening and characterization of the U-box gene family inMedicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 130-141.

收稿日期：2015-02-25；改回日期：2015-04-09

基金項目：國家自然科學基金(31372362)項目和“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAD17B01)資助。

作者簡介：鄭興衛(1987-)，女，河北定州人，在讀博士。E-mail:smilezxw@126.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail:licong0520@sina.com

Genome-wide screening and characterization of the U-box gene family inMedicagotruncatula

ZHENG Xing-Wei, SHAO Lin-Hui, LI Cong*

InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193，China

Abstract:The U-box domain genes typically exist in multiple variants within plant genomes, and most of them belong to the ubiquitin/proteasome system as E3ubiquitin ligase. They play key roles in the regulation of growth, in development, in reproduction as well as in response to environmental stress. In this study, bioinformatics methods were applied to identify U-box family genes of M. truncatula through whole genome screening. A phylogenetic tree was created using the MEGA6 program. Gene structure and chromosome location were defined by GSDS and Mapinspect. A total of 41 U-box genes distributed unevenly on 8 chromosomes were identified from M. truncatula. The U-box proteins were classified into six major classes based on their motif compositions and phylogeny relationships. The expression profiles of M. truncatula U-box genes showed characteristics of tissue specificity and response to salt, drought and nitrogen stress. These results will be useful for future functional analyses of the U-box family genes in M. truncatula.

Key words:Medicago truncatula; U-box gene family; phylogenetic analysis; expression patterns

U-box基因家族是一類具有U-box結構域的基因家族，其編碼蛋白大部分是泛素系統中決定底物識別特性的泛素連接酶E3[1]，也有部分U-box蛋白質屬于泛素鏈聚集因子E4[2]。作為E3的U-box蛋白在真核生物，特別是植物中廣泛存在，在與細胞周期、信號轉導、逆境反應、轉錄調節、DNA修復、細胞凋亡、形態發生、分泌途徑等過程有關的蛋白質降解途徑中發揮著重要作用[3-6]。

U-box基序最初是從具有泛素鏈聚集酶 E4活性的酵母蛋白質 UFD2 中鑒定出來的[7]。第一個被鑒定出具體結構的植物U-box蛋白為擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtPUB14蛋白質[8]。近年來，隨著越來越多的 U-box 蛋白質被鑒定出來，其結構與功能也逐漸引起了人們的關注。研究表明，U-box 結構域由大約70個氨基酸組成，該結構域在真菌、植物和動物等真核生物中高度保守。在目前已鑒定出的真核生物U-box蛋白中，植物U-box(plant U-box protein，PUB)蛋白的數目遠遠多于其他生物[3]。如酵母中有 2 個 U-box 基因，在人中有 21 個 U-box 基因[4,7,9]，而經基因組序列分析預測，擬南芥基因組中存在64個U-box基因[10-11]，水稻(Oryzasativa)中已鑒定出77個帶有U-box結構的基因[12]。到目前為止，多種植物的PUB蛋白基因功能已經被驗證：1)PUB蛋白參與植物的防御反應。編碼擬南芥AtPUB17和與其同源的煙草(Nicotianabenthamiana)ACRE276蛋白的基因能正調控細胞凋亡和植物防御的過程[13]。AtPUB19通過負調節 ABA信號調控植物的干旱脅迫響應過程[14]。超表達擬南芥的 PUB22 和 PUB23能夠增加其對干旱脅迫的敏感性[15]。辣椒(Capsicumannuum)中的U-Box 蛋白質CaPUB1，在擬南芥中超表達后植株的耐鹽性增加[16]。CMPG1 在煙草與番茄(Solanumlycopersicum)中參與多個抗病基因介導的抗性反應[17]。2)一些植物U-box蛋白調控植株生長和生殖發育過程。水稻OsPUB15突變后，導致種子不能長出初生根，幼苗生長緩慢甚至死亡[18]。擬南芥AtPUB4基因突變后，影響絨氈層細胞降解途徑，使花粉粒粘連導致雄性不育[19]。ACR1在蕓薹屬植物雌蕊中作用于其下游的S 受體激酶，促進了雌蕊中兼容性因子的泛素化降解，最終導致花粉自交不親和[20]。并且擬南芥PUB13和同源基因水稻SPL11同時能夠調控植物的細胞死亡、抗病和開花時間[21]，證明植物在發育和先天免疫反應方面具有信號交叉。

蒺藜苜蓿是豆科苜蓿屬一年生植物，由于其具有生育期短(80~100 d)、基因組較小(454~526 Mb)、二倍體(2n=16)、自花授粉、易于轉化、再生時間較短等特點被作為豆科模式植物進行研究[22-23]。蒺藜苜蓿與大部分豆科植物具有相似的遺傳性，從蒺藜苜蓿獲得的信息對其他豆科植物具有重要的參考價值。因此，蒺藜苜蓿成為繼擬南芥和水稻進行基因組序列測定之后第3個基因組完整測序的模式植物[24-25]。蒺藜苜蓿全基因組序列公布后仍在不斷完善，目前，利用生物信息學方法分析基因家族的特征、進化關系成為熱點。本研究利用生物信息學方法對蒺藜苜蓿全基因組中的U-box基因家族的種類、數目、基因結構、染色體定位、系統發生和基因表達模式等進行分析，旨在為豆科植物育種提供重要的理論依據。

1材料與方法

1.1　數據來源

試驗于2014年8月至2015年1月進行。最新的蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)全基因組數據和蛋白質數據(Mt4.0)下載于JVCI蒺藜苜蓿測序網站(http://medicago.jcvi.org/medicago/)[26]；擬南芥U-box基因家族蛋白序列和基因序列下載于擬南芥U-box基因家族網站(http://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/pub.jsp)[10]；水稻U-box基因家族蛋白序列下載于水稻全基因組數據庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)[27]；蒺藜苜蓿基因芯片表達數據下載自蒺藜苜蓿基因表達圖譜數據庫(MtGEA v3，http://mtgea.noble.org/v3/)[28]。

1.2　蒺藜苜蓿U-box 基因家族成員鑒定

首先利用蒺藜苜蓿全基因組序列構建本地BLAST數據庫[29]，以目前擬南芥已經鑒定出的所有U-box基因家族成員，共64個蛋白的基因序列對蒺藜苜蓿基因組數據庫執行本地BLAST搜索，E value設為0.001；同時將Pfam數據庫[30]中U-box保守結構域序列下載并提取出來(PF04565)，利用Hmmer v3.1b1[31](http://hmmer.janelia.org/)構建隱馬爾科夫模型(HMM)，在Mt4.0v1蛋白數據庫中搜索含有U-box結構域的候選序列。合并上述兩部分結果，手工剔除無完整讀碼框的序列。所得結果利用Pfam和SMART[32](http://smart.embl-heidelberg.de/)在線工具進一步分析結構域，去除無典型U-box結構域的序列，最終得到蒺藜苜蓿的U-box基因。利用ExPASy Proteomics Server(http://www.expasy.org/proteomics)對所有蒺藜苜蓿U-box蛋白氨基酸序列進行分子量、等電點預測。

1.3　U-box家族系統發育樹的構建及蛋白結構域分析

通過Clustal W[33]程序對蒺藜苜蓿U-box蛋白進行多序列聯配比對分析，序列聯配比對結果使用MEGA6[34]程序采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)生成基因的系統進化樹，替換模式為“Poisson model”，缺口設置為“Pairwise deletion”，校驗參數Bootstrap重復1000次。利用在線工具SMART分析U-box基因家族蛋白的結構域組成。

1.4　蒺藜苜蓿U-box家族基因結構及染色體定位分析

在得到每個基因信息的同時得到了基因的DNA序列，包括基因的cDNA序列，再用在線工具GSDS[35](http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)得到基因結構圖。同時獲得了這些基因的染色體位置信息，利用Mapinspect工具標出每個U-box結構域基因在染色體組上的位置，從而得到每個U-box結構域基因在基因組中的分布情況。

1.5　蒺藜苜蓿U-box家族基因表達模式分析

根據41個蒺藜苜蓿U-box基因對應的CDS序列，在蒺藜苜蓿基因芯片平臺BLAST搜索其對應的探針，獲得探針的表達量信息。將39個不同組織器官、不同處理下的基因芯片數據通過CIMminer在線分析軟件鑒定蒺藜苜蓿U-box家族表達差異基因，并作出熱圖(heat-map)，最后對蒺藜苜蓿U-box基因的表達情況進行聚類分析。

2結果與分析

2.1　蒺藜苜蓿U-box基因家族信息

通過本地BLAST比對以及Hmmer搜索，去除不含U-box典型結構域的序列，最終從已發表的蒺藜苜蓿全基因組中鑒定出41個U-box 基因家族成員，如表1所示。通過Pfam和SMART工具進行蛋白質結構分析，41個蒺藜苜蓿U-box蛋白均含有約60~70個氨基酸的U-box保守結構域。通過ExPASy工具分析，蒺藜苜蓿中最長的U-box蛋白(登錄號：Medtr1g090320.1)包含1490個氨基酸殘基，分子量大小為41個蛋白中的最大值167.08 kD，最短的U-box蛋白(登錄號：Medtr2g007630.1)包含259個氨基酸殘基，分子量最小，為28.73 kD。等電點范圍為5.28(Medtr7g078330.1)~9.24(Medtr2g007630.1)。

2.2　蒺藜苜蓿U-box家族系統進化及蛋白結構域分析

為研究蒺藜苜蓿U-box基因家族系統進化關系，對最終篩選出的41個蒺藜苜蓿U-box蛋白進行了系統進化樹的構建。經過SMART蛋白結構域分析發現，除U-box結構域外，蒺藜苜蓿U-box蛋白還含有其他結構域。根據進化樹及蛋白結構域(圖1)，并參考擬南芥和水稻的U-box基因家族分類結果(表2)，本文將蒺藜苜蓿中41個U-box蛋白分為6種類型，分別包含18，12，5，3，2和1個蒺藜苜蓿U-box蛋白家族成員。ARM亞家族在植物中研究最多，并且在擬南芥和水稻中都被鑒定為最大的亞類，在蒺藜苜蓿中為第2大亞類。在擬南芥和水稻中根據N端保守位點甘氨酸、賴氨酸/精氨酸和亮氨酸定義的GKL+U-box亞家族，因為其結構域分析與U-box only亞類沒有區別，因此在本文中歸為U-box only亞類，U-box only結構的PUB蛋白在蒺藜苜蓿中的數量最多，共18個。Kinase亞家族有5個成員，其中3個成員含絲/蘇氨酸蛋白激酶結構域(S_TKc domain)，另外兩個為絲/蘇/酪氨酸蛋白激酶結構域(STYKc domain)。含有WD40重復結構和TPR結構的U-box基因在蒺藜苜蓿中分別有3和2個。MtPUB28是蒺藜苜蓿中唯一含有UFD2結構的U-box蛋白。

為了深入分析與其他物種同源基因的進化關系，對蒺藜苜蓿與擬南芥和水稻的U-box/ARM亞類進行了系統進化樹的構建(圖2)。結果顯示，與擬南芥或水稻中的同源基因相比，大部分蒺藜苜蓿U-box/ARM基因與蒺藜苜蓿家族內部的同源基因的遺傳距離更加接近。然而，MtPUB25、MtPUB32和MtPUB34在擬南芥中都存在與其遺傳距離最近的直系同源蛋白。

表1　蒺藜苜蓿基因組中的U-box基因

圖1　蒺藜苜蓿U-box家族進化樹及蛋白結構Fig.1　The neighbor joining phylogenetic tree and structure of U-box proteins in M. truncatula　使用U-box蛋白的氨基酸序列構建進化樹，分支上數字代表校驗參數Bootstrap重復1000次時該節點可信度The phylogenetic tree was constructed by using the amino acid sequences of the U-box proteins. The numbers on the branches mean the reliability percent of Bootstraps value based on 1000 replication.

圖2　蒺藜苜蓿與擬南芥、水稻U-box/ARM蛋白的系統發生關系Fig.2　Phylogenetic relationship of M. truncatula, Arabidopsis and O. sativa U-box/ARM proteins　紅色表示蒺藜苜蓿U-box/ARM蛋白，藍色表示擬南芥U-box/ARM蛋白，綠色表示水稻U-box/ARM蛋白。The red labels indicate U-box/ARM protein in M. truncatula, while blue and green ones indicate U-box/ARM in Arabidopsis and O. sativa, respectively.

2.3　蒺藜苜蓿U-box家族基因結構及染色體定位分析

對家族成員的基因結構分析顯示(圖3)，蒺藜苜蓿U-box家族基因結構差異較大，內含子數目從0個到16個數目不等。進一步分析發現，蒺藜苜蓿U-box蛋白分類中的I類，即U-box only亞類，其基因結構較為簡單，大多數不含內含子或僅含有1個內含子，僅有3個基因含有3個以上的內含子。II類(U-box/ARM亞類)中每個基因的內含子數目不超過4個。III類(Kinase/U-box亞類)中基因的內含子數目在6~9個之間，IV類(U-box/WD40亞類)的3個基因所含內含子數目最多，分別為16個、15個和13個。V類(TPR/U-box亞類)的2個基因均含有7個內含子。僅包含1個基因的VI類(UFD2/U-box亞類)，Medtr6g013690.1基因含有15個內含子。

表2　蒺藜苜蓿、擬南芥和水稻U-box蛋白的結構域組成

圖3　41個蒺藜苜蓿U-box基因的結構分析Fig.3　Gene structure of 41 U-box gene in M. truncatla

通過提取蒺藜苜蓿U-box基因的染色體定位信息，得到41個U-box基因在蒺藜苜蓿8條染色體上的定位圖(圖4)。由圖4可知，蒺藜苜蓿U-box基因在染色體上呈不均等分布。其中5號染色體分布最多，共含有10個U-box基因，而4號染色體上分布的U-box基因最少，僅有2個U-box成員。另外，U-box基因在染色體上的分布呈現區域性，從3號、5號、7號和8號染色體中可以看到，在染色體上的某一區域家族成員個數比較密集。

圖4　蒺藜苜蓿U-box基因在染色體上的定位Fig.4　Chromosomal locations of U-box genes in M. truncatula

2.4　蒺藜苜蓿U-box家族基因表達模式分析

利用蒺藜苜蓿MtGEA數據庫進行的組織表達分析結果(圖5)表明，共有37個U-box基因在數據庫中有表達數據。聚類圖中用綠-黑-紅三色代表基因表達的強度，紅色越亮代表信號越強，綠色越亮代表信號越弱，黑色代表中間水平。結果顯示，Medtr5g020570.1、Medtr5g020570.2在葉片中特異性表達，Medtr5g077510.1和Medtr3g008082.1主要在根中表達，Medtr1g017770.1與Medtr3g065080.1在營養器官中表達量高，Medtr1g079450.1和Medtr7g116600.1在種皮中特異性表達。Medtr1g044720.1普遍存在于蒺藜苜蓿葉、莖、花和種子等組織中，表達量較為豐富，而Medtr5g048050.1、Medtr5g083030.1、Medtr5g090510.1、Medtr6g071340.1和Medtr7g005940.1在各組織中表達量都很低。

圖5　蒺藜苜蓿U-box基因表達模式Fig.5　The expression profile of the M. truncatula U-box genes

同時，根據不同處理下的芯片數據，還分析了不同脅迫處理下蒺藜苜蓿U-box基因的表達模式，包括鹽(200 mmol/L NaCl)、干旱、低氮(N2、NO3-、NH4+)處理。結果顯示，鹽脅迫下9個基因(Medtr1g017770.1、Medtr2g018010.1、Medtr3g095730.1、Medtr4g107010.1、Medtr5g034440.1、Medtr5g048050.1、Medtr5g077510.1、Medtr6g071340.1和Medtr7g117890.1)在根中表達量上調，表明這些基因可能會參與植株幼苗期對鹽脅迫的響應。水分脅迫下，在幼苗和根中檢測到的U-box基因表達量變化并不一致。干旱處理后在幼苗中表達量上調的基因有Medtr4g107010.1和Medtr6g013690.1兩個，Medtr4g085720.1、Medtr5g020570.1、Medtr5g020570.2和Medtr7g116600.1四個基因則表現為干旱時表達量降低，脅迫解除后又恢復甚至超過正常值。而在干旱脅迫后的根中，Medtr1g044720.1基因表達量上調，表達量下降的有10個基因(Medtr3g008270.1、Medtr3g008280.1、Medtr3g095730.1、Medtr4g085720.1、Medtr5g020570.1、Medtr5g020570.2、 Medtr7g005940.1、Medtr7g077780.1、Medtr8g092870.1和Medtr8g093310.1)。N素(N2、NO3-、NH4+)脅迫下，Medtr4g085720.1和Medtr4g107010.1 在幼苗中響應脅迫，表達量都上調，而根中這兩個基因表達量基本不受N素(NO3-、NH4+)脅迫的影響。Medtr7g005940.1在幼苗和根中對NH4+脅迫響應都比NO3-敏感。

3討論

隨著多種植物基因組測序的完成，利用全基因組數據對基因家族進行系統分析和預測基因功能已成為植物基因功能研究所關注的重要問題[37-39]。蒺藜苜蓿作為豆科的模式植物，其基因組測序完成后，WRKY[40-41]、LBD[42]、MADS-box[43]及NBS[44]等家族都進行了廣泛的生物信息學分析。U-box蛋白在植物生殖發育及抗逆機制中發揮著至關重要的作用，是當前生物學研究的熱點。本研究在蒺藜苜蓿基因組中鑒定出41個U-box基因，這與之前擬南芥(64個)[39]和水稻(77個)[36]等植物的報導存在一定差異，這說明U-box基因家族并不與基因組大小有直接的關系，這與Zeng等[12]在水稻U-box基因家族研究中的結論一致。

U-box功能域是一種被修飾的RING-finger結構，它不具有RING-finger type蛋白質中由半胱氨酸和組氨酸及兩個鋅離子構成的金屬離子螯合殘基，而是用鹽鍵和氫鍵來穩定其結構[45]。除了N端的U-box結構域外，U-box蛋白中通常還存在一些與蛋白相互作用密切相關的二級結構域，主要用來介導U-box蛋白與底物蛋白的特異性識別。本研究中根據除U-box結構域外的其他結構域的種類，將蒺藜苜蓿中的41個U-box蛋白家族成員分為6個亞家族。U-box/ARM亞家族成員是目前植物U-box家族基因中功能研究最多的亞類。擬南芥和水稻均為研究最為深入的模式植物，突變體類型較蒺藜苜蓿更為豐富，芯片數據更加全面完整，U-box基因功能也得到了更加廣泛的驗證。研究表明，U-box/ARM蛋白通過多個ARM基序相互銜接形成獨特的結構以提供蛋白-蛋白相互作用的場所，參與植物的自交不親和、抗病、相應非生物脅迫、激素信號轉導等多個過程。本文對蒺藜苜蓿與擬南芥、水稻的U-box/ARM亞家族進行了聯合系統進化分析，發現與單子葉的水稻相比，蒺藜苜蓿U-box基因與同是雙子葉的擬南芥更容易聚為一類，并且U-box基因家族在物種間進化上是較為保守的(圖2)，所以可以認為與擬南芥聚類在一起的蒺藜苜蓿U-box基因也能具有類似的功能。基于擬南芥中基因功能已報導或基因組中已注釋的U-box/ARM基因的分析結果[46-47]，可以對蒺藜苜蓿的U-box基因家族進行功能預測分析。在磷酸鹽缺失條件下，擬南芥AtPUB9與其上游信號AtARK2共同調控植株側根發育[48]，與其對應的蒺藜苜蓿同源蛋白MtPUB32可能也具有類似功能。擬南芥AtPUB18和AtPUB19是同源基因，參與ABA介導的干旱脅迫響應過程，并且與AtPUB22和AtPUB23響應干旱脅迫的過程相互獨立[49-52]，蒺藜苜蓿中MtPUB26與AtPUB18和AtPUB19同源，可能也參與到類似的干旱響應過程。

本文通過對蒺藜苜蓿基因芯片信息分析發現，根據蒺藜苜蓿U-box家族基因在8個不同組織的表達顯示，不同的U-box家族成員在表達上具有一定的組織特異性，暗示U-box家族成員間存在功能特異性。而陳浩等[53]通過選取水稻中4個U-box蛋白質進行Western blotting檢測和EST數據比較分析，得出4個U-box蛋白質在水稻生長發育的不同時期或部位為組成型表達，且表達量接近。這可能與物種間存在差異有關，或者與不同研究中所涉及的轉錄譜數據和EST數據存在差異有關。多個U-box蛋白基因在鹽、干旱和氮素脅迫條件下，表達量出現上調或下調的變化，暗示這些基因在調控逆境脅迫過程中能夠發揮作用。

目前國內外對U-box基因功能的研究主要采用酵母雙雜交篩選與其相互作用的下游蛋白[54]，以及基于RNA沉默或基因敲除的反向遺傳學辦法[19]。通過研究蒺藜苜蓿U-box蛋白的結構與功能，尋找與其相互作用的靶蛋白，將有助于了解植物體內蛋白與蛋白的互作機制，從而揭示U-box基因如何調控蒺藜苜蓿的生長發育，以及如何參與對逆境脅迫的信號轉導過程。

References：

[1]Shigetsugu H, Kei-ichi I N. U-box proteins as a new family of ubiquitin ligases. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 302(4): 635-645.

[2]Aravind L, Eugene V K. The U box is a modified RING finger-a common domain in ubiquitination. Current Biology, 2000, 10(4): 132-134.

[3]Patterson C. A new gun in town: the U box is a ubiquitin ligase domain. Science’s STKE, 2002, 2002(116): pe4.

[4]Hatakeyama S, Yada M, Matsumoto M,etal. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. The Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(35): 33111-33120.

[5]Hatakeyama S, Nakayama K I. U-box proteins as a new family of ubiquitin ligases. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 302(4): 635-645.

[6]Andersen P, Kragelund B B, Olsen A N,etal. Structure and biochemical function of a prototypicalArabidopsisU-box domain. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(38): 40053-40061.

[7]VanDemark A P, Hill C P. Structural basis of ubiquitylation. Current Opinion Structural Biology, 2002, 12(6): 822-830.

[8]Koegl M, Hoppe T, Schlenker S,etal. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell, 1999, 96(5): 635-644.

[9]Ohi M D, Vander Kooi C W, Rosenberg J A,etal. Structural insights into the U-box, a domain associated with multi-ubiquitination. Nature Structural Biology, 2003, 10(4): 250-255.

[10]Azevedo C, Santos-Rosa M J, Shirasu K. The U-box protein family in plants. Trends in Plant Science, 2001, 6(8): 354-358.

[11]Wiborg J, O’Shea C, Skriver K. Biochemical function of typical and variantArabidopsisthalianaU-box E3 ubiquitin-protein ligases. Biochemistry Journal, 2008, 413(3): 447-457.

[12]Zeng L R, Park C H, Venu R C,etal. Classification, expression pattern, and E3 ligase activity assay of rice U-box-containing proteins. Molecular Plant, 2008, 1(5): 800-815.

[13]Yang C W, GonzAilez-Lamothe, Rocio,etal. The E3 ubiquitin ligase activity ofArabidopsisPLANT U-BOX17 and its functional tobacco homolog ACRE276 are required for cell death and defense. The Plant Cell, 2006, 18(4): 1084-1098.

[14]Samuel M A, Mudgil Y, Salt J N,etal. Interactions between the S-domain receptor kinases and AtPUB-ARM E3 ubiquitin ligases suggest a conserved signaling pathway inArabidopsis. Plant Physiology, 2008, 147(4): 2084-2095.

[15]Cho S K, Ryu M Y, Song C,etal.ArabidopsisPUB22 and PUB23 are homologous U-Box E3 ubiquitin ligases that play combinatory roles in response to drought stress. Plant Cell, 2008, 20(7): 1899-1914.

[16]Cho S K, Chung H S, Ryu M Y,etal. Heterologous expression and molecular and cellular characterization of CaPUB1 encoding a hot pepper U-Box E3 ubiquitin ligase homolog. Plant Physiology, 2006, 142(4): 1664-1682.

[17]Gonzalez-Lamothe R, Tsitsigiannis D I, Ludwig A A,etal. The U-box protein CMPG1 is required for efficient activation of defense mechanisms triggered by multiple resistance genes in tobacco and tomato. Plant Cell, 2006, 18(4): 1067-1083.

[18]Park J J, Yi J, Yoon J,etal. OsPUB15, an E3 ubiquitin ligase, functions to reduce cellular oxidative stress during seedling establishment. The Plant Journal, 2011, 65(2): 194-205.

[19]Wang H, Lu Y, Jiang T,etal. TheArabidopsisU-box/ARM 1 repeat E3 ligase AtPUB4 influences growth and degeneration of tapetal cells, and its mutation leads to conditional male sterility. The Plant Journal, 2013, 74(3): 511-523.

[20]Stone S L, Anderson E M, Mullen R T,etal. ARC1 is an E3 ubiquitin ligase and promotes the ubiquitination of proteins during the rejection of self-incompatibleBrassicapollen. Plant Cell, 2003, 15(4): 885-898.

[21]Liu J, Li W, Ning Y,etal. The U-box E3 ligase SPL11/PUB13 is a convergence point of defense and flowering signaling in plants. Plant Physiology, 2012, 160(1): 28-37.

[22]Wang Y, Liu W X, Ma L C,etal. Research progresses inMedicagotruncatulagenetic transformation. Pratacultural Science, 2014, 31(3): 504-511.

[23]Wei Z W, Gai J Y. Model legume:Medicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2008, 17(1): 114-120.

[24]Gary S, Marc L, Laurent B,etal. Genetics and functional genomics of legume nodulation. Current Opinion in Plant Biology, 2006, 9(2): 110-121.

[25]Endre G, Kereszt A, Kevei Z,etal. A receptor kinase gene regulating symbiotic nodule development. Nature, 2002, 417: 962-966.

[26]Tang H, Krishnakumar V, Bidwell S,etal. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legumeMedicagotruncatula. BMC Genomics, 2014, 15: 312.

[27]Kawahara Y, de la Bastide M, Hamilton J P,etal. Improvement of theOryzasativaNipponbare reference genome using next generation sequence and optical map data. Rice, 2013, 6: 4.

[28]He J, Benedito V A, Wang M,etal. TheMedicagotruncatulagene expression atlas web server. BMC Bioinformatics, 2009, 10: 441.

[29]Braun R C, Pedretti K T, Casavant T L,etal. Parallelization of local BLAST service on workstation cluster. Future Generation Computer System, 2001, 17(6): 745-754.

[30]Finn R D, Mistry J, Schuster-Bockler B,etal. Pfam: clans, web tools and services. Nucleic Acid Research, 2006, 34(S1): 247-251.

[31]Finn R D, Clements J, Eddy S R.HMMER web server: interactive sequence similarity searching. Nucleic Acid Research, 2011, 39(S2): 29-37.

[32]Letunic I, Doerks T, Bork P. SMART 6: recent updates and new developments. Nucleic Acid Research, 2009, 37(S1): 229-232.

[33]Larkin M A, Blackshields G, Brown N P,etal. Clustal W and Clustal X version 2.0.Bioinformatics, 2007, 23(21): 2947-2948.

[34]Tamura K, Stecher G, Peterson D,etal. MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30: 2725-2729.

[35]Hu B, Jin J, Guo A,etal. GSDS 2.0: an upgraded gene feature visualization server. Bioinformatics, 2014, doi: 10.1093/bioinformatics/btu817.

[36]Cao Y H. The Characteristics of Rice U-Box Gene Family with its Transcription and Expression Pattern Analysis[D]. Baoding: Agricultural University of Hebei Province, 2012.

[37]Jiang G G, Song L L, Guo D L,etal. Genome-wide association mapping of aluminum tolerance inMedicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(4): 170-178.

[38]Kang J M, Zhang T J, Yang Q C,etal. Research progress in the quantitative trait loci (QTL) and genomic selection of alfalfa. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(6): 304-312.

[39]Lu Y Q, Guan N, Li C. Advanced in the study on U-box proteins ofArabidopsisthaliana. Molecular Plant Breeding, 2008, 6(5): 941-948.

[40]Jiang T, Lin Y X, Lin X,etal. Genome-wide analysis of the WRKY transcription factor family inMedicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2011, 20(3): 211-218.

[41]Song H, Nan Z B. Genome-wide identification and analysis of WRKY transcription factors inMedicagotruncatula. Hereditas, 2014, 36(2): 152-168.

[42]Jia X T, Liu W X, Xie W G,etal. Genome-wide analysis of the LBD transcription factor family inMedicagotruncatula. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2014, 34(10): 2176-2187.

[43]Zhang J, Song L L, Guo D L,etal. Genome-wide identification and investigation of the MADS-box family inMedicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(6): 233-241.

[44]Zhao Y, Jiang H Y, Wang J M,etal. Analysis of genome-wide disease resistance genes and their expansion inMedicagotruncatula. Journal of Agricultural Biotechnology, 2009, 17(6): 1062-1069.

[45]Donna Y, Daphne R G. The diversity of plant U-box E3 ubiquitin ligases: from upstream activators to downstream target substrates. Journal of Experimental Botany, 2009, 60(4): 1109-1121.

[46]Yang J, Lan X G, Li Y H. U-box/ARM proteins in plants. Plant Physiology Communications, 2008, 44(6): 1216-1222.

[47]Vogelmann K, Subert C, Danzberger N,etal. Plasma membrane-association of SAUL1-type plant U-box armadillo repeat proteins is conserved in land plants. Frontiers in Plant Science, 2014, 5: 37.

[48]Drechsel G, Bergler J, Wippel K,etal. C-terminal armadillo repeats are essential and sufficient for association of the plant U-box armadillo E3 ubiquitin ligase SAUL1 with the plasma membrane. Journal of Experimental Botany, 2011, 62(2): 775-785.

[49]Srijani D, Subramanian S, Gayathri W,etal. The S-domain receptor kinase AtARK2 and the U- box/ARM-repeat-containing E3 ubiquitin ligase 9 module mediates lateral root development under phosphate starvation inArabidopsis. Plant Physiology, 2014, 165(4): 1647-1656.

[50]Yashwanti M, Shiu S H, Sophia L S,etal. A large complement of the predictedArabidopsisARM repeat protein are members of the U-box E3 ubiquitin ligase family. Plant Physiology, 2004, 134(1): 59-66.

[51]Jakob W, Charlotte O S, Karen S. Biochemical function of typical and variantArabidopsisthalianaU-box E3 ubiquitin-protein ligase. Biochemical Journal, 2008, 413: 447-457.

[52]Seo D H, Ryu M Y, Jammes F,etal. Roles of fourArabidopsisU-Box E3 ubiquitin ligases in negative regulation of abscisic acid-mediated drought stress responses. Plant Physiology, 2012, 160(1): 556-568.

[53]Chen H, Li L Y, Bai H,etal. Expression analysis of rice U-Box proteins at different developmental stages. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2009, 36(9): 1208-1214.

[54]Mbengue M, Camut S, de Carvalho-Niebel F,etal. TheMedicagotruncatulaE3 ubiquitin ligase PUB1 interacts with the LYK3 symbiotic receptor and negatively regulates infection and nodulation. The Plant Cell, 2010, 22(10): 3474-3488. doi: 10.1105/tpc.110.075861.

參考文獻：

[22]王宇, 劉文獻, 馬利超, 等. 蒺藜苜蓿遺傳轉化體系研究進展. 草業科學, 2014, 31(3): 504-511.

[23]魏臻武, 蓋鈞鎰. 豆科模式植物——蒺藜苜蓿. 草業學報, 2008, 17(1): 114-120.

[36]曹英豪. 水稻U-box基因家族的特征及轉錄表達模式分析[D]. 保定: 河北農業大學, 2010.

[37]姜格格, 宋麗莉, 郭東林, 等. 蒺藜苜蓿耐酸鋁性狀的全基因組關聯分析. 草業學報, 2013, 22(4): 170-178.

[38]康俊梅, 張鐵軍, 楊青川, 等. 紫花苜蓿QTL與全基因組選擇研究進展及其應用. 草業學報, 2014, 23(6): 304-312.

[39]魯玉清, 關寧, 李聰. 擬南芥U-box蛋白的研究進展. 分子植物育種, 2008, 6(5): 941-948.

[40]江騰, 林勇祥, 林雪, 等. 苜蓿全基因組WRKY轉錄因子基因的分析. 草業學報, 2011, 20(3): 211-218.

[41]宋輝, 南志標. 蒺藜苜蓿全基因組中WRKY轉錄因子的鑒定與分析. 遺傳, 2014, 36(2): 152-168.

[42]賈喜濤, 劉文獻, 謝文剛, 等. 蒺藜苜蓿LBD轉錄因子家族全基因組分析. 西北植物學報, 2014, 34(10): 2176-2187.

[43]張軍, 宋麗莉, 郭東林, 等. MADS-box基因家族在蒺藜苜蓿的全基因組分析. 草業學報, 2014, 23(6): 233-241.

[44]趙陽, 江海洋, 汪結明, 等. 蒺藜苜蓿全基因組抗病基因和基因擴張分析. 農業生物技術學報, 2009, 17(6): 1062-1069.

[46]楊佳, 藍興國, 李玉花. 植物U-box/ARM蛋白. 植物生理學通訊, 2008, 44(6): 1216-1222.

[53]陳浩, 李莉云, 白輝, 等. 水稻U-Box蛋白質在不同發育時期的表達分析. 生物化學與生物物理進展, 2009, 36(9): 1208-1214.