辣椒青枯病生防菌的分離和鑒定

史忠良　(淮安生物工程高等職業學校,江蘇淮安 223200)

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辣椒青枯病生防菌的分離和鑒定

史忠良(淮安生物工程高等職業學校,江蘇淮安 223200)

辣椒青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的一種以土壤傳播為主的細菌性病害[1]。目前對該病的防治主要以化學手段為主，但長期大量施用化學農藥易產生抗藥性和造成環境污染，因此，生物防治受到國內外研究者的廣泛重視[2]。目前已在多種作物體內分離篩選到具有抗菌活性并對青枯雷爾氏菌有較好抑制效果的內生細菌[3]。然而關于辣椒青枯病內生拮抗菌篩選的報道較少[4]。筆者從辣椒青枯病發病區健康辣椒植株體內篩選出1株對辣椒青枯雷爾氏菌有較強拮抗作用的內生細菌，并對該抗生菌進行了鑒定，旨在為辣椒青枯病的防治提供借鑒。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。辣椒青枯雷爾氏菌(R.solanacearumC3)由淮安生物工程高等職業學校實驗室分離。

1.1.2培養基。分離篩選用YGPA培養基，其組成為：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，瓊脂18 g，H2O 1 000 ml，pH 7.2。

1.1.3試劑。試驗用試劑均為優級純，用于高效液相色譜分析的為色譜純。

1.2方法

1.2.1生防菌的分離。取辣椒植株用自來水沖洗，再用滅菌水沖洗干凈，將表面水分用滅菌濾紙吸干，用無菌刀除去莖桿表皮，切取黃豆粒大小的組織塊(木質部)，在75%乙醇中浸泡1 min，然后用0.1%氯化汞消毒2 min，用滅菌水沖洗3次，加入10 ml無菌水于滅菌的研缽中研磨，靜置30 min左右，在YGPA培養基平板上涂抹浸出液0.1 ml，30 ℃恒溫培養72 h，以滅菌水沖洗消毒后組織用的第3次沖洗液作為對照，若對照中無菌落，在研磨液中長出菌落是內生細菌。

1.2.2生防菌的純化。在分離平板長出單菌落后，挑取形態不同的單菌落重新于YGPA培養基平板上劃線純化，置于28～30 ℃恒溫箱中倒置培養48 h，挑取單菌落編號后用YGPA斜面培養基4 ℃保存。

1.2.3生防菌的篩選。采用點接法篩選分離得到的菌株。在YGPA培養基平板上涂布培養18 h的濃度為1×108cfu/ml的青枯雷爾氏菌病原菌懸液0.1 ml，然后用無菌牙簽在每個平板上均勻接種4個參試菌株，3個重復，30 ℃恒溫培養24 h后測定其抑菌圈直徑。

1.2.4生防菌拮抗效能的測定。采用牛津杯平板擴散法(雙層營養瓊脂)。將平板底層倒一薄層YGPA固體培養基凝固后，每個平板放置3個滅菌牛津杯，然后將YGPA培養基與培養48 h的青枯雷爾氏菌(菌液濃度為1×108cfu/ml)混合，凝固后將牛津杯取出，然后取搖床培養18 h(28 ℃，200 r/min)的拮抗菌培養液0.2 ml加入每個孔中，30 ℃恒溫培養48 h后，測定拮抗效能，3次重復。

1.2.5生防菌的鑒定。

1.2.5.1菌落形態觀察。將內生細菌接種在YGPA培養基平板上， 1～2 d后觀察菌落形態、菌落的邊緣及菌落的高度。

1.2.5.2革蘭氏染色。YGPA培養基平板上培養18 h內取一環置于載玻片上，涂成均勻薄層，微火固定后，滴加1～2滴草酸銨結晶紫覆蓋涂片處，染色1 min，水洗，加碘液染1 min，水洗，用95%乙醇脫色后，再滴番紅染液復染1 min，水洗，濾紙吸干后于光學顯微鏡下觀察菌體的著色情況；觀察菌體形態。

2結果與分析

2.1內生菌的分離與篩選從健康辣椒植株體內共分離到35株內生菌株，經室內平板拮抗試驗，得到8株拮抗細菌(表1)。其中，CQW菌株對辣椒青枯雷爾氏菌有較強的抗菌活性，抑菌圈直徑接近16 mm。因此，選用CQW菌株進行后續試驗。

表1　內生菌對青枯雷爾氏菌的拮抗作用

2.2CQW菌株的鑒定

2.2.1培養特征。革蘭氏陽性(G+)(圖1)，短桿狀，大小為(0.6～0.8)μm×(2.1～2.5)μm(圖2)，產芽孢。

2.2.2菌體形態。在YGPA培養基上呈白色半透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規則(圖3)。

2.2.316S rDNA基因序列測定與分析。以CQW菌株基因組DNA為模板，用細菌的通用引物進行 PCR擴增，擴增產物經上海博亞生物技術有限公司測序，測得16S rDNA 擴增片段長度為1 458 bp。使用Blastn程序進行比對和構建系統發育樹(圖4)，表明CQW菌株與Bacillusspp.聚為一類，且與Bacilluscereus菌株親緣關系最近，同源性達100%，結合CQW 菌株的形態特征，確定CQW菌株為芽孢桿菌屬的蠟樣芽孢桿菌(B.cereusCQW)，登記號為KF016033。

3結論與討論

該研究驗從辣椒健康植株體內分離到35株菌株，其中8株優良菌株對辣椒青枯病有抑菌作用，根據內生菌對病原菌拮抗能力的差異篩選得出CQW菌株，發現CQW菌株產生的抗菌活性最強，具有較好的應用價值。通過形態鑒定和16S rDNA初步確定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

辣椒青枯病的發生越來越普遍和嚴重，已引起許多研究者的高度重視。植物內生細菌是植物微生態系統中的天然組成成分，利用內生細菌防治植物病害是一個新興的領域，它們的存在對于加強植物適應環境具有重要意義[5]。某些內生細菌不僅能夠抑制病原菌的生長，而且能夠促進寄主的生長，它們既可以作為生物防治劑也可以作為植物促生劑應用于生產[6]。該試驗結果可為辣椒青枯病的防治提供參考。

參考文獻

[1] HAYWARD A C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused byPseudomonassolanacearum[J]. Annu Rev Phytopatho1, 1991, 29: 65-87.

[2] 張海利，陳永兵，徐堅.番茄青枯病生物防治研究進展[J].農業科技通訊，2008(8): 98-101.

[3] 易有金，劉如石，尹華群，等.煙草青枯病拮抗內生細菌的分離、鑒定及其田間防效[J].應用生態學報，2007，18(3): 554-558.

[4] 陳敏，許麗君，吳斌娟，等.黃瓜青枯病內生拮抗菌株HE-1的初步鑒定及培養優化條件[J].科技通報，2008，24(4): 489-493.

[5] 彭細橋，周國生，鄧正平，等.煙草青枯病內生拮抗菌的篩選、鑒定及其防效測定[J].植物病理學報，2007，37(6): 670-674.

[6] 袁軍，孫福在.防治馬鈴薯環腐病有益內生細菌的分離和篩選[J].微生物學報，2002，42(3): 270-274.

摘要[目的]篩選辣椒青枯病內生拮抗菌，為辣椒青枯病防治提供參考。[方法]通過生防菌拮抗效能的測定從辣椒青枯病發病區健康辣椒植株體內分離對辣椒青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)有較強拮抗作用的內生細菌，并通過形態鑒定、16S rDNA同源性序列分析對其進行鑒定。[結果]從辣椒青枯病發病區健康植株體內分離篩選到1株對辣椒青枯病有較強拮抗作用的細菌CQW菌株，初步鑒定其為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。[結論]為辣椒青枯病防治提供了資源菌。

關鍵詞辣椒青枯病；生防菌；分離；鑒定

Separation and Identification of Biocontrol Bacteria against Pepper Bacterial Wilt

SHI Zhong-liang(Huai’an Bioengineering Higher Vocational School，Huai’an，Jiangsu 223200)

Abstract[Objective] Biocontrol bacteria against pepper bacterial wilt were screened out to provide reference for controlling the disease.[Method] Some biocontrol bacteria against R.solanacearum were separated from healthy pepper plants in diseased area of pepper bacterial wilt，and then identified through morphological identification and 16S rDNA homologous sequence analysis.[Result] Biocontrol bacteria CQW was obtained and identified as Bacillus cereus.[Conclusion] The research provides new resource for controlling pepper bacterial wilt.

Key wordsPepper bacterial wilt; Biocontrol bacteria; Separation; Identification

收稿日期2015-04-30

作者簡介史忠良(1976- )，男，江蘇淮安人，講師，從事農業資源利用研究。

中圖分類號S 432.4+2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-128-02