油樟葉總黃酮和總多糖的抑菌活性

杜永華　敖光輝　魏琴等

摘要：采用紙片擴散法、二倍稀釋法、平板菌落計數法測定了油樟葉總黃酮、總多糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌3種細菌的抑菌活性。結果表明，油樟葉總黃酮、總多糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制活性均表現出一定的濃度依賴性，其MIC分別為16.000、8.000、16.000 mg/mL和16.000、16.000、32.000 mg/mL，MBC分別為16.000、16.000、32.000 mg/mL和16.000、32.000、64.000 mg/mL。油樟葉總黃酮和總多糖均明顯干擾受試菌的正常生長過程。

關鍵詞：油樟；黃酮；多糖；抑菌活性

中圖分類號： R285.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0408-03

收稿日期：2014-11-24

基金項目：四川省基礎研究項目（編號：2011JY0050）；四川省青年科技創新研究團隊培育計劃（編號：2011JTD0035）；四川省省屬高校科研創新團隊建設計劃（編號：14TD0031）。

作者簡介：杜永華（1978—），男，四川遂寧人，碩士，講師，主要從事天然產物及其生物活性研究。E-mail：yonghuad@163.com。

通信作者：魏琴，博士，教授，主要從事植物資源開發利用研究。E-mail：weiqin2011-67@163.com 。油樟[Cinnamomum longepaniculatum （Gamble） N. Chao]屬樟科樟屬植物，是我國特有樹種，主產于四川省宜賓市，其枝葉均富含揮發油，是食品、香料、醫藥、日用、化工產品的重要原料來源[1-2]。油樟與藥用植物香樟[Cinnamomum camphora （Linn.） Presl]為同屬植物，均具有多種藥理活性。研究表明，油樟葉揮發油具有較強的抗微生物活性[3-6]，提取揮發油后的油樟葉殘渣提取物具有抗微生物作用[7-10]。目前關于油樟葉提取揮發油后殘渣的化學成分及其生物活性研究較少，關于油樟葉中總黃酮的抗菌活性研究未見報道。本試驗對油樟葉提取揮發油后殘渣中的總黃酮進行抗菌活性研究，旨在為油樟資源的開發利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

油樟葉采自宜賓市翠屏區邱場鄉油樟種植基地；蕓香苷標準品（含量≥92.5%，批號100080—200707，中國藥品生物制品檢定所）；D（+）-無水葡萄糖標準品（含量≥98%，貴州迪大科技有限責任公司）；青霉素G鉀鹽（1 440 U/mg，Sigma 公司）；硫酸鏈霉素（720 U/mg，Sigma公司）；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2菌種與培養基

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由宜賓學院發酵資源與應用四川省高校重點實驗室提供。營養瓊脂（NA）液體培養基：0.5 g牛肉膏，1 g蛋白胨，0.5 g氯化鈉，加熱攪拌溶解于100 mL蒸餾水中，調節pH值至7.3±0.1，121 ℃下高壓滅菌20 min，該培養基中加入1.5 g瓊脂即為固體培養基。

1.3主要儀器

AR2130電子天平（賽多利斯公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；LG-5A真空冷凍干燥機（上海離心機機械研究所有限公司）。

1.4方法

1.4.1油樟葉總黃酮的制備將新鮮油樟葉自然晾干，用水蒸氣蒸餾法除去揮發油，殘渣（60±1） ℃烘干，粉碎，取過60～80目篩油樟葉粉末50 g，按料液比1 g ∶21 mL加入體積分數為50%的乙醇溶液，室溫浸泡36 min，88 ℃水浴回流提取105 min；過濾，濾液于60 ℃減壓濃縮至浸膏，加100 mL 蒸餾水溶解，加入適量石油醚萃取至石油醚層無色，取水層濃縮至50 mL，加入乙醇溶液調節乙醇終濃度至80%，4 ℃醇沉過夜（除去多糖、蛋白、鞣質等雜質）；過濾，濾液減壓濃縮至膏稠狀，真空冷凍干燥，得總黃酮粗品。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色體系[11]測定油樟葉總黃酮含量。將油樟總黃酮粗品用10%乙醇溶液配制成濃度為64.00 mg/mL的儲備液，用直徑為0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.4.2油樟葉總多糖的制備取過60～80目篩除去揮發油的油樟葉干燥粉末50 g，按料液比1 g ∶20 mL加入水，100 ℃水浴回流提取3 h，過濾，濾液濃縮至1/5體積，加入乙醇溶液調節乙醇終濃度至80%，4 ℃醇沉過夜，12 000 r/min冷凍離心5 min，取沉淀真空冷凍干燥，得總多糖粗品。采用苯酚-硫酸法測定油樟葉總多糖含量。將油樟總多糖粗品用無菌水配制成濃度為64.00 mg/mL的儲備液，用直徑為0.22 μm 的微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.4.3菌株活化及菌懸液制備無菌條件下將保藏菌種接入NA平板培養基，37 ℃恒溫培養18～24 h；挑去單個特征菌落接種于5 mL滅菌NA液體培養基中，37 ℃恒溫培養18～24 h；取0.5 mL菌懸液加入4.5 mL NA液體培養基中，用血細胞計數板計數，用NA液體培養基稀釋菌懸液使其濃度為105～106 CFU/mL[7]，備用。

1.4.4抑菌效果的測定采用紙片瓊脂擴散法[12]測定測試物的抑菌效果。將定性濾紙制成直徑為6 mm的圓紙片，置于潔凈干燥的試管內，121 ℃濕熱滅菌20 min后烘干。測定100片濾紙片吸水量，根據吸水量在無菌條件下滴加不同濃度的藥液，使油樟總黃酮粗品、總多糖粗品的紙片含藥量均分別為512.00、256.00、170.67 μg/片，陽性對照紙片含藥量為青霉素G鉀鹽10 U/片、硫酸鏈霉素10 μg/片，37 ℃干燥后密閉低溫保存備用。取0.5 mL各菌懸液分別涂布于NA平板培養基上，每個平皿放4張含藥濾紙，分別為油樟葉總黃酮、總多糖的3個濃度梯度及1個陽性對照，每個濃度3個平行。以放溶劑紙片的加菌培養基為溶劑對照，不加菌培養基為無菌對照。37 ℃恒溫培養箱培養24 h，觀察是否有抑菌圈，若有，則用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.4.5最小抑菌濃度（MIC）的測定采用二倍稀釋法[7]將油樟葉總黃酮粗品、總多糖粗品用相應無菌溶劑稀釋成64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL的系列溶液，分別取0.5 mL總黃酮、總多糖溶液至4 mL NA液體培養基中，加入0.5 mL菌懸液，充分搖勻，37 ℃、 115 r/min搖床培養24 h，每個濃度重復3次，同時設無菌對照組（不含菌的NA液體培養基）、溶劑對照組（加相應溶劑的含菌NA液體培養基）。用肉眼觀察法觀察每支試管中細菌的生長情況，以完全不長菌的濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

1.4.6最小殺菌濃度（MBC）的測定在MIC基礎上，從未見細菌生長的試管中取出0.5 mL培養物加入裝有4.5 mL NA液體培養基中，37 ℃培養24 h，取0.1 mL培養液用涂布平板法計數，以菌落數少于5個的最低濃度為油樟葉總黃酮、總多糖對該菌的最小殺菌濃度（MBC）[7]。

1.4.7抑菌曲線的測定參考陶翠等的方法[4]，用NA液體培養基將油樟葉總黃酮粗品、總多糖粗品配制成MIC濃度，分別接種3種細菌，使其終濃度為105 CFU/mL，充分混勻后于37 ℃培養，分別于0、2、4、8、12、24、36、48 h吸取1.0 mL菌液，按10倍比例稀釋，加入19 mL NA培養基混勻后制成平板，37 ℃培養24 h后計算菌落，根據稀釋濃度計算1 mL活菌數，以菌落數的對數為因變量，以培養時間為自變量在直角坐標系中作圖，即得油樟葉總黃酮或總多糖對細菌的時間抑菌曲線，同時設含相應菌的培養基空白對照。

2結果與分析

2.1油樟葉總黃酮、總多糖含量測定

50 g提取揮發油后的油樟葉渣經醇提法提取總黃酮，冷凍干燥獲得油樟葉總黃酮粗品4.60 g，經比色法測得油樟葉總黃酮粗品中總黃酮含量為381.83 mg/g，油樟葉總黃酮提取率為3.51%；獲得油樟葉總多糖粗品2.65 g，經苯酚-硫酸法測定總多糖粗品中總多糖含量為371.22 mg/g，總多糖提取率為1.97%。

2.2油樟葉總黃酮、總多糖的抑菌效果

由表1可知，油樟葉總黃酮、總多糖粗品對3株細菌均具有一定的抑菌作用，其抑菌圈直徑隨著紙片含藥量的增加而增加，表現出一定的劑量依耐性，但均低于陽性對照組。油樟總黃酮粗品對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈基本上大于油樟總多糖粗品，但油樟總多糖粗品對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大于油樟總黃酮粗品。陽性藥物組對相應細菌的抑菌圈均達到美國抗微生物藥物敏感性試驗執行標準（CLSI）的敏感水平，溶劑對照組、無菌對照組均無異常現象。512.0 μg/片油樟總黃酮粗品對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑是10 U/片青霉素G鉀鹽的30.3%，對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑是青霉素G鉀鹽的50.0%。

2.3油樟葉總黃酮、總多糖的最小抑菌濃度

由表2可知，無菌對照組無菌生長，溶劑對照組有菌生長。油樟葉總黃酮和總多糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為16.000、8.000、16.000 mg/mL和16.000、16.000、32.000 mg/mL。

2.4油樟葉總黃酮、總多糖的最小殺菌濃度

由表3可知，無菌對照組無菌生長，溶劑對照組有菌生長。油樟葉總黃酮、總多糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌作用24 h后的最小殺菌濃度分別為16.000、16.000、32.000 mg/mL和16.000、32.000、64.000 mg/mL。

2.5油樟葉總黃酮、總多糖抑菌曲線

由圖1至圖3可知，3種細菌在溶劑對照中均能正常生長，有較明顯的調整期、對數期、穩定期、衰亡期。油樟葉總黃酮、總多糖在1倍MIC下，金黃色葡萄球菌均直接進入了衰亡期，表現出明顯的殺菌作用；1倍MIC總黃酮使枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的調整期延長，無明顯對數期、穩定期，24 h內緩慢生長，但活菌數量較溶劑對照組低，隨即進入衰亡期；

3結論與討論

本試驗結果表明，油樟葉總黃酮、總多糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均具有一定的抑菌活性，其抑菌效果隨著總黃酮、總多糖濃度的增加而增強。油樟總黃酮對金黃色葡萄球菌的MIC、MBC與總多糖相同，說明總黃酮、總多糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用相當。總黃酮對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的MIC、MBC均低于總多糖，表明總黃酮對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制作用強于總多糖。這一現象與光石韋總黃酮和多糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的作用趨勢相似[12]。油樟葉總黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌活性（MIC均為16.000 mg/mL）強于油樟葉乙醇提取物 （MIC均為31.25 mg/mL）[7]。與油樟同屬植物香樟葉在除去揮發油后的乙醇提取物主要成分為黃酮類化合物，其黃酮類化合物提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均有較強抗菌活性[13-14]。由此可知，油樟葉總黃酮可能是油樟葉乙醇提取物中主要的抑菌成分。油樟葉總多糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性（MIC分別為16.000、32.000 mg/mL）弱于香樟葉水提取物（MIC均為15.63 mg/mL）[15]。孫崇魯研究表明，香樟葉水提取物含有較多的多糖成分[16]。但油樟葉總多糖的抑菌活性是否弱于香樟葉總多糖還有待進一步研究。

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