MRFs家族基因在鯉魚紅肌和白肌中的表達差異

張明　呂明　李瑞文等

摘要：為探索生肌調節因子（myogenic regulator factors，MRFs）家族基因在鯉魚肌纖維形成中的基本作用，利用熒光定量PCR技術分別檢測MRFs家族各成員在鯉魚紅肌、白肌中的表達差異，并與紅肌纖維的標志基因MyHCⅠ及白肌纖維的標志基因MyHCⅡ的表達水平進行關聯分析。結果表明，MyoD基因在鯉紅肌中的表達極顯著高于在白肌中的表達，并與MyHCⅠ基因的表達呈顯著正相關，Myf6在鯉魚白肌中的表達極顯著高于其在紅肌中的表達水平，并與MyHCⅡ基因的表達呈顯著正相關，Myf5、MyoG在鯉魚紅肌、白肌中的表達水平差異不顯著。

關鍵詞：MRFs家族基因；紅肌；背肌；腹肌；鯉

中圖分類號： S917文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0049-02

收稿日期：2014-11-26

基金項目：國家自然科學基金（編號：31201990）；四川省應用基礎研究計劃（編號：2014JY0088）；西南民族大學國家級大學生創新創業訓練計劃（編號：X201410656057）。

作者簡介：張明（1988—），男，重慶人，從事生物技術研究。E-mail：zhangmingcoming@163.com。

通信作者：林亞秋，副教授，從事動物肉質調控研究。 E-mail：linyq1999@163.com。肌纖維類型及其組成對動物肉品質具有重要影響，肌纖維類型主要包括兩大類：Ⅰ型（紅肌、慢肌）、Ⅱ型（白肌、快肌）肌纖維。不同類型肌纖維特性不同（如收縮功能、線粒體成分、代謝特性等），進而導致肌肉品質存在差別[1-2]。研究表明，若肌肉中紅肌纖維比例高于白肌纖維，則肌肉的品質較好[3-4]。Toniolo等將肌球蛋白重鏈 （myosin heavy chain，MyHC） 基因的同工型作為肌纖維類型的分子標志[5]。生肌調節因子（myogenic regulator factors，MRFs） 家族基因在動物肌纖維的形成、分化中具有重要的調控作用，該家族編碼MyoD1、Myf5、MyoG、Myf6等4種肌肉特異性轉錄因子具有不同的時空表達特性[6-8]。本研究利用熒光定量PCR技術分析生肌調節因子家族MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6基因在鯉魚紅肌、白肌（背肌、腹肌）中的表達差異，并與紅肌、白肌纖維標志基因MyHCⅠ、MyHCⅡ的表達水平進行關聯分析，初步確定該家族基因在鯉魚肌纖維形成中的作用，旨在為通過肌纖維類型調控魚類肉質提供依據。

1材料與方法

1.1樣品的采集

所用鯉魚購自西北農林科技大學安康水產試驗示范站。選擇體質量為500 g左右的成年鯉魚6尾，致死后迅速取其背部紅肌、背肌、腹肌組織，用錫箔紙包好，置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2主要試劑

TRIzol總RNA提取試劑盒與SYBRPremix Ex TaqTM （2×）均購自大連TaKaRa公司；反轉錄試劑盒、TaqDNA聚合酶均購自Fermentas公司；DEPC原液由Sigma公司分裝。

1.3方法

1.3.1鯉魚紅肌、白肌組織總RNA提取與反轉錄取出備用的鯉魚紅肌、白肌組織，按照TRIzol試劑盒說明書的方法提取肌肉組織的RNA，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，同時利用紫外分光光度計測定RNA的濃度。按照反轉錄試劑盒說明書的方法，取1 g總RNA，以Oligo （dT） 為引物反轉錄成cDNA第一鏈。

1.3.2引物的設計與合成根據GenBank上登陸的β-actin、MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6、MyHCⅠ、MyHCⅡ序列（表1），利用Primier 5.0軟件設計這些基因的特異引物用來擴增在鯉魚紅肌、白肌中的表達差異。

1.3.3實時熒光定量PCR利用熒光定量PCR檢測MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6、MyHCⅠ、MyHCⅡ基因在鯉紅肌、白肌中的表達水平。總反應體系為20 μL，其中SYBRPremix Ex TaqTM （2×）PCR 10 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，57.6～62.3 ℃退火30 s，45個循環；72 ℃延伸30 s。

1.3.4數據分析采用SPSS 13.0軟件分析數據，所得數據用“平均值±標準差”表示，采用ANOVA進行差異性顯著檢驗分析。熒光定量結果采用2-ΔΔCT 方法進行分析[9]。

2結果與分析

2.1MyoD、Myf5、MyoG、Myf6基因在鯉魚紅肌、白肌中的表達差異

熒光定量檢測MRFs家族基因在鯉魚紅肌、背肌、腹肌中的表達結果（圖1至圖4）顯示，MyoD基因在鯉魚紅肌中的表達水平極顯著高于在背肌、腹肌中的表達水平。Myf6基因在鯉魚背肌、腹肌中的表達水平極顯著高于其在紅肌中的表達水平。Myf5、MyoG基因在鯉魚紅肌與背肌、腹肌中的表達水平差異不顯著。

2.2MRFs家族基因與肌纖維標志基因MyHCⅠ、MyHCⅡ的相關性

MyoD基因在鯉魚紅肌中的表達水平與MyHCⅠ基因的表1基因特異引物序列

基因名稱特異引物序列退火溫度表達呈極顯著正相關（r=0.908，P<0.01），Myf6在鯉魚白肌中的表達水平與MyHCⅡ基因的表達呈極顯著正相關（r=1.000，P<0.01）。

3結論與討論

MRFs家族基因都具有典型的堿性螺旋環結構，控制著動物肌肉發育的整個過程（包括成肌細胞的增殖、分化和肌纖維的形成），是動物肌肉發育過程中重要的正向調控因子。因此研究其在魚類肌纖維形成中的作用具有重要意義。MRFs家族基因在哺乳動物、魚類中的組織分布不同，在哺乳動物中僅在肌肉組織中表達[10-11]，在魚類多種組織中均存在表達，但主要分布在肌肉組織中[12-14]。生肌調節因子在紅肌、白肌中表達水平的差異對2種肌肉的肌纖維形成、肌肉生長率有影響。本研究結果表明，MyoD基因在鯉魚紅肌中的表達水平極顯著高于其在白肌（背肌、腹肌）中的表達水平，并與紅肌纖維的標志基因呈顯著正相關。Myf6基因在鯉魚背肌、腹肌中的表達水平極顯著高于其在紅肌中的表達水平，并與白肌纖維的標志基因呈顯著正相關。MyoG、Myf5基因在鯉魚紅肌中的表達水平與在背肌和腹肌中的表達水平差異不顯著，可見MyoD可能在鯉魚的紅肌纖維形成中發揮主要作用，Myf6基因可能在鯉魚的白肌纖維形成中發揮主要作用。MyoD在嚙齒動物的白肌中表達量較高，Myogenin卻表達量較低[15]，這與本試驗結果不同，可能具有物種特異性。

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