高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞GH基因多態性及生物信息學分析

楊紅++張勇++田啟培等

摘要：以高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞為研究對象，構建品種DNA池，PCR擴增生長激素（GH）基因所有外顯子和部分內含子序列，采用直接測序法對3個雞種的GH基因進行多態性檢測，利用生物信息學軟件預測不同多態性位點對GH基因mRNA二級結構的影響，旨在通過對貴州脛長差異較大的高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞GH基因的多態性及其生物信息學進行分析，研究GH基因對不同雞種脛骨發育的影響。結果表明：在高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞3個雞種GH基因中共檢測到8個SNPs位點，其中A1133G、G1166A位于第2內含子區，C2027G、C2030T位于第4外顯子區，G2152A位于第4內含子區，G3347A位于第5外顯子區，T3416C和C3436T位于3′非編碼區。生物信息學分析顯示位于外顯子區的3個SNPs均為同義突變，對GH基因的mRNA二級結構有一定影響。

關鍵詞：DNA池；GH基因；脛骨長度；SNPs；高腳雞；矮腳雞；百宜黑雞

中圖分類號：S831.2文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2015）11-0038-04

收稿日期：2014-11-03

基金項目：貴州省科技計劃（編號：黔合科NZ字[2012]3007號）；貴州省農業動植物育種專項（編號：黔農育專字[2012]10號）；浙江大學基本科研業務費專項資金（編號：2012XZZX003-1）。

作者簡介：楊紅（1990—），女，碩士研究生，研究方向為動物遺傳育種與種質資源創新。Email：15085933126@139.com。

通信作者：王芳芳，女，高級畜牧師，主要從事家禽遺傳育種及飼養管理工作。E-mail：1587676665@qq.com。貴州省地形復雜、地貌特殊，具有豐富的地方雞種資源，其中包括竹鄉雞、威寧雞、黔東南小香雞、高腳雞、矮腳雞、百宜黑雞等。高腳雞、矮腳雞、百宜黑雞均為貴州省特有的地方雞種，在體型外貌尤其是脛骨長度上存在較大差異。高腳雞是貴州省特有的地方品種，1982年錄入《貴州省畜禽品種志》，2006年錄入《中國畜禽資源名錄》，其脛骨比其他品種雞長3～4 cm，公雞平均脛長13.62 cm、母雞平均脛長 10.92 cm[1]。矮腳雞分布于貴州省黔西南州興義市，其脛長較普通雞短，公雞平均脛長6.5 cm、母雞平均脛長5.9 cm[2]，1993年錄入《貴州省畜禽品種志》。百宜黑雞為貴州優質地方雞種，主產地為貴陽市烏當區百宜鄉[3]，其脛骨長度介于高腳雞和矮腳之間。

雞生長激素（chiken growth hormone，cGH）是由垂體前葉合成和分泌的一種多肽類激素，由191個氨基酸組成。研究報道稱該激素在雞生長發育、骨骼生長、脂肪沉積、飼料轉化及產蛋等方面具有調節作用[4]。該基因位于1號染色體，全長近4 kb，由5個外顯子和4個內含子組成，且內含子遠大于外顯子[5-6]。國內外學者相繼發現GH基因的多態位點對雞各類生長性狀有特定影響[7-10]。對于貴州省境內部分雞種的GH基因已有相關研究，如朱麗莉等對興義矮腳雞GH基因的多態性研究中發現該雞種在第一內含子區域存在較多變異[11]。黃波等在對貴州小香雞GH基因研究中，對GH基因2～3外顯子區域SNP位點進行了檢測并開展了相關性分析[12]。本試驗選擇脛骨長度差異較大的高腳雞、矮腳雞、百宜黑雞作為對象，研究GH基因的多態性，并進行生物信息學分析，旨在檢測GH基因在不同脛長性狀雞種中的差異，以期探究GH基因多態性與脛骨生長發育的關系，為進一步研究影響脛骨發育機制的功能基因奠定工作基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物高腳雞92個血樣采自貴州省安順市普定縣，矮腳雞99個血樣采自貴州省黔西南州興義市興牧畜禽水產科技服務中心矮腳雞養殖場，百宜黑雞69個血樣采自其中心產區貴州省貴陽市百宜鄉。每羽雞翅下靜脈采血2～3 mL于真空采血管中，肝素鈉抗凝，-20 ℃保存。

1.1.2主要試劑血液基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix、核酸染料、DL2000 DNA Marker 等試劑均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。實驗室自備試劑為去離子水、無水乙醇、TAE緩沖液等。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取、檢測及構建DNA池運用上海生工生物工程技術服務有限公司血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，凝膠成像系統照相保存，并用紫外分光光度計測量DNA樣品濃度，每個樣品測量3次，取平均值。用ddH2O將所有DNA樣品調至100 ng/μL，各取10 μL構建品種DNA池[13]，-20 ℃保存備用。

1.2.2引物設計與PCR擴增參照GenBank（登錄號為 NC_006114.3）提供的雞GH基因序列，運用 Primer Premier 6.0 和 Oligo 6.0 設計引物，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列及擴增條件如表1。

2結果與分析

2.1DNA提取結果

將提取的DNA用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果見圖1。由圖1可見，DNA條帶集中，整齊明亮無拖尾，可用于下一步試驗。

2.2PCR產物檢測結果

PCR產物用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2：所檢測片段與預期片段大小相符，條帶清晰、整齊無拖尾，PCR產物特異性較好，可用于進一步測序分析。

2.3序列分析

在所擴增的序列中共發現6個SNPs 位點：第2內含子A1133G、G1166A，第4外顯子C2027G、C2030T，第4內含子G2152A，第5外顯子G3347A，3′非編碼區T3416C、 C3436T（圖3）。

2.4等位基因頻率估算

從表2可見，3個雞種在A1133G、G1166A、C2027G、G2152A、C3436T這5個SNPs位點上基因頻率存在較大差異。

2.5GH基因所有外顯子RNA二級結構預測結果

采用在線軟件 RNAfold web server分別對在GH基因外顯子中的3個 SNPs 位點 mRNA進行預測，結果見圖4。

3討論

雞脛骨為全身長骨之一，其生長過程受到多種激素及細胞因子調控，且存在不同的信號通路。GH基因是調控禽類整個機體的重要激素，具有加快肌肉和骨骼生長、促進生長發育及提高飼料報酬的作用[15-17]，也有研究報道稱GH基因可促進雞長骨和軟骨的發育[18]。朱麗莉等對貴州個體較小的矮腳雞、小香雞的GH基因進行了多態性分析，發現較多變異位點，通過關聯性分析得到該基因對體斜長、脛長、脛圍等生長性狀有一定的影響[11-12]。

本研究對脛長差異較大的高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞的GH基因所有外顯子和部分內含子進行了單核苷酸多態性檢測，發現了8個可能與脛長性狀相關的SNPs位點，分別為A1133G、G1166A、C2027G、C2030T、G2152A、G3347A、T3416C、C3436T。其中C2027G、C2030T等2個SNPs位點位于第4外顯子區，G3347A位于第5外顯子區，3個位于外顯子區域的SNP位點均為同義突變。

各SNPs位點分析發現，在第2內含子區A1133G處，只有高腳雞發生了突變，矮腳雞與百宜黑雞均未發生突變；第4內含子G2152A處，高腳雞的優勢堿基為G，矮腳雞與百宜黑雞的優勢堿基則為A；3′非編碼區C3436T處，高腳雞未發現SNPs位點，而矮腳雞、百宜黑雞卻存在突變。這表明高腳雞在A1133G、G2152A、C3436T這3個SNPs位點上與其他2個雞種存在較大差異，推測這2個SNPs位點可能對高腳雞脛骨長度有較大影響。在G1166A、C2027G位點處，矮腳雞發生突變的基因頻率與高腳雞和百宜黑雞差異較大，推測這2個SNPs位點可能與矮腳雞脛骨較短存在相關性。同時，在C2027G位點處，這3個貴州地方雞種的優勢堿基均為G，而GenBank（登錄號為NC_006114.3）中所報道的則為C，這可能是貴州地方雞種的一個共同特征，同時也是貴州地方雞種與其他雞種之間所存在的普遍差異。

真核生物的基因一般由若干個外顯子和內含子組成，為斷裂基因，外顯子的功能是構成編碼區編碼功能蛋白，編碼區內核苷酸的變異可能導致基因mRNA二級結構改變，進而導致蛋白質結構改變而影響其生物功能[15]。本研究中所檢測出的3個SNPs位點均未引起所編碼氨基酸改變，為同義突變。運用生物信息學軟件進行進一步分析發現，所檢測到的3個SNPs位點均導致了GH基因mRNA二級結構改變，使其最小自由能發生變化，從而影響mRNA二級結構穩定性。當C2027G發生C→G突變后，GH基因mRNA二級結構最小自由能增加了167.894 kJ/mol，其穩定性減弱；當C2030T發生C→T突變后，GH基因mRNA二級結構最小自由能減少了2.51 kJ/mol，其結構穩定性增加；當G3347A發生G→T突變后，GH基因mRNA二級結構最小自由能增加了7.093 kJ/mol，其結構穩定性減弱。GH基因突變與雞脛骨長度的關系及其引起的mRNA二級結構變化所發生的生物學意義將在后續試驗中進一步加以研究。

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