草莓MADS—box基因家族生物信息學(xué)分析

摘要：通過(guò)生物信息學(xué)的方法，利用擬南芥、水稻的MADS-box基因?qū)Σ葺甅ADS-box基因家族進(jìn)行鑒定和分析，共得到83個(gè)草莓MADS-box候選基因，且MADS-box結(jié)構(gòu)域高度保守。進(jìn)化分析表明，F(xiàn)vMADS1-FvMADS33可被細(xì)分為10個(gè)亞組，分別為AG、AGL12、AGL6、AGL2、SE、SVP、FLC、AP3、SOC1、AGL17；FvMADS34-FvMADS83可被細(xì)分為4個(gè)亞組，分別為Mα（22個(gè)成員）、Mβ（1個(gè)成員）、Mγ（17個(gè)成員）、Mδ（10個(gè)成員）。

關(guān)鍵詞：草莓；MADS-box轉(zhuǎn)錄因子；基因家族；生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)： S668.403文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0021-05

收稿日期：2014-12-22

基金項(xiàng)目：中國(guó)教育學(xué)會(huì)學(xué)校文化研究分會(huì)“十二五”教育科研課題（編號(hào)：0613278A）。

作者簡(jiǎn)介：馬明臻（1979—），女，山東壽光人，碩士，副教授，主要從事園藝植物栽培研究。E-mail：1538543122@qq.com。草莓因其漿果營(yíng)養(yǎng)豐富、鮮紅亮麗、酸甜可口、芳香多汁而深受消費(fèi)者喜愛(ài)，我國(guó)是世界草莓第一生產(chǎn)大國(guó)，但產(chǎn)量水平仍不足發(fā)達(dá)國(guó)家的1/2[1-2]。由于草莓存在高雜合性、多倍性等問(wèn)題，使其常規(guī)育種周期長(zhǎng)、工作量大、效率低。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的興起和發(fā)展，草莓生物技術(shù)育種獲得了極大進(jìn)步。MADS-box基因廣泛參與植物花和果實(shí)的發(fā)育、成熟等多個(gè)過(guò)程。開(kāi)展草莓MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的研究，有利于探索和解析草莓花、果實(shí)在發(fā)育成熟等生理過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制，并能為生物技術(shù)育種提供有價(jià)值的信息。

MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的N末端區(qū)域含有一段約為60個(gè)氨基酸殘基的保守域，稱(chēng)為MADS-box保守域，負(fù)責(zé)綁定目的基因中調(diào)控區(qū)域的CArG盒子（CC（A/T）6GG）[3]。MADS-box基因家族成員可根據(jù)進(jìn)化關(guān)系分為類(lèi)型Ⅰ（Type Ⅰ）和類(lèi)型Ⅱ（Type Ⅱ）[4]。類(lèi)型Ⅱ MADS-box轉(zhuǎn)錄因子不僅含有MADS保守域，還含有Intervening（Ⅰ）區(qū)域、Keratin（K）盒、C-terminal（C）末端3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[5]，因此類(lèi)型Ⅱ又被稱(chēng)為MIKC類(lèi)型。相對(duì)于Type Ⅱ，Type Ⅰ結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單且缺乏K盒。類(lèi)型Ⅰ可根據(jù)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)一步分為4種類(lèi)型：Ma、Mβ、Mγ、Mδ[7]。近年來(lái)，隨著對(duì)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子研究的不斷深入，現(xiàn)已提出主要調(diào)控花發(fā)育過(guò)程的ABCDE模型。ABCDE模型認(rèn)為，A、E類(lèi)基因調(diào)控萼片的發(fā)育；A、B、E類(lèi)基因共同調(diào)控花瓣的發(fā)育；B、C、E類(lèi)基因共同調(diào)控雄蕊的發(fā)育；C、E類(lèi)基因調(diào)控心皮的發(fā)育；D、E類(lèi)基因調(diào)控胚珠的發(fā)育[5，8-9]。

本研究以森林草莓（Fragaria vesca）基因組功能數(shù)據(jù)庫(kù)[10]為出發(fā)點(diǎn)，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)草莓MADS-box基因家族成員的數(shù)目、進(jìn)化關(guān)系、亞組分類(lèi)進(jìn)行分析，以期為揭示花和果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、加快生物技術(shù)育種等問(wèn)題提供理論基礎(chǔ)，并為MADS-box基因的進(jìn)一步克隆提供參考。

1材料與方法

1.1材料

根據(jù)擬南芥中已鑒別的MADS-box基因家族蛋白質(zhì)序列和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)的MADS-box保守域（PF00319）序列，利用NCBI提供的BlastP程序（http：//www.rosaceae.org/tools/ncbiblast）檢索草莓基因組功能數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/strawberry/），并下載目的蛋白質(zhì)序列。為進(jìn)一步確認(rèn)候選MADS-box基因的保守結(jié)構(gòu)域，將候選MADS-box基因逐一提交至NCBI的在線工具Conserved Domain Search（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.sanger.ac.uk/search）進(jìn)行MADS-box保守區(qū)域確認(rèn)，對(duì)含有MADS-box保守域的候選基因進(jìn)行下一步分析[11]。

1.2方法

利用DNAMAN 6.0序列分析軟件、WebLogo 3在線軟件（http：//weblogo.threeplusone.com/）分析草莓MADS-box基因保守序列。利用MEGA 4.1進(jìn)化樹(shù)分析軟件（http：//www.megasoftware.net）并根據(jù)NJ方法[執(zhí)行參數(shù)：Poission correction、pairwise deletion、bootstrap（1 000次重復(fù)）]，引入擬南芥（AGL）和水稻（OsMADS）的MADS-box蛋白對(duì)草莓MADS-box基因進(jìn)行亞組分類(lèi)。擬南芥、水稻的MADS-box蛋白序列分別下載于擬南芥（http：//www.arabidopsis.org/）、水稻基因組網(wǎng)站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）[12-13]。

2結(jié)果與分析

2.1草莓MADS-box基因家族的鑒定

通過(guò)NCBI提供的BlastP程序搜索草莓基因組功能數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到83個(gè)MADS-box候選基因，其開(kāi)放閱讀框、編碼氨基酸、分子量、等電點(diǎn)、染色體定位、NCBI預(yù)測(cè)基因、與擬南芥同源基因的相關(guān)信息見(jiàn)表1。

2.2草莓MADS-box基因家族保守結(jié)構(gòu)域序列分析

利用DNAMAN 6.0序列分析軟件、WebLogo 3在線軟件對(duì)草莓MADS-box基因家族保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)表1草莓MADS-box基因家族成員信息

FvMADS 基因家族高度保守。經(jīng)WebLogo 3在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，在MADS-box保守結(jié)構(gòu)域，氨基酸23（R）、30（K）位點(diǎn)是保守不變的（圖1）。

2.3草莓MADS-box基因家族進(jìn)化分析

利用MEGA 4.1進(jìn)化樹(shù)分析軟件對(duì)83個(gè)FvMADS、62個(gè)OsMADS、70個(gè)AGL蛋白的MADS-box結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，215個(gè)MADS-box成員被分為T(mén)ype Ⅰ、Type Ⅱ共2組，其中FvMADS1-FvMADS33屬于Type Ⅱ，F(xiàn)vMADS34-FvMADS83屬于Type Ⅰ。40個(gè)OsMADS、39個(gè)AGL屬于Type Ⅱ，22個(gè)OsMADS、31個(gè)AGL屬于Type Ⅰ。對(duì)33個(gè)FvMADS進(jìn)一步分析表明，F(xiàn)vMADS1-FvMADS33可被細(xì)分為10個(gè)亞組（圖2），分別是AG（FvMADS21、22、24）、AGL12（FvMADS28）、AGL6（FvMADS17）、AGL2（FvMADS4、6、26）、SEP（FvMADS23）、SVP（FvMADS1、2、3、5、12、20）、FLC（FvMADS7、8、11、25、30、31、33）、AP3（FvMADS9、10、15、27）、SOC1（FvMADS13、14、16、18、19）、AGL17（FvMADS29）。對(duì)50個(gè)FvMADS進(jìn)一步分析表明，F(xiàn)vMADS34-FvMADS83可被細(xì)分為4個(gè)亞組（圖3），分別是Mα（22個(gè)成員）、Mβ（1個(gè)成員）、Mγ（17個(gè)成員）、Mδ（10個(gè)成員）。

3結(jié)論與討論

MADS-Box基因家族廣泛存在于高等植物中，參與調(diào)控花的發(fā)育，果實(shí)的發(fā)育、成熟、開(kāi)裂，根的生長(zhǎng)發(fā)育、根瘤的形成，頂端分生組織的分化，以及營(yíng)養(yǎng)代謝、光合作用等許多過(guò)程[12]。近年來(lái)，隨著植物全基因組測(cè)序工作的不斷完成，在基因組層面研究植物的相關(guān)基因家族得以實(shí)現(xiàn)。2011年，草莓全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成[10]，草莓NAC基因家族、SBP基因家族已通過(guò)生物信息學(xué)方法得以鑒定[14-15]。擬南芥[6]、水稻[7]、毛果楊[16]、葡萄[17]、黃瓜[18]、大豆[19]、梅花[20]、大白菜[21]、蘋(píng)果[11]的MADS-box基因家族鑒定和進(jìn)化分析也相繼完成。不同物種MADS-box基因家族成員的數(shù)量存在較大差異，在擬南芥、毛果楊、葡萄、水稻、黃瓜、大豆、梅花、大白菜、蘋(píng)果中分別鑒定得到107、105、32、71、43、163、80、160、143個(gè)MADS-box基因，各物種MADS-box基因家族成員的分類(lèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法系統(tǒng)地鑒定并分析了83個(gè)草莓MADS-box候選基因，其中MIKCC、MIKC*類(lèi)型分別為32、1個(gè)；Mα、Mβ、Mγ、Mδ分別為22、1、17、10個(gè)（表2）。盡管擬南芥、毛果楊、葡萄、水稻、黃瓜、大豆、梅花、大白菜、蘋(píng)果MADS-box基因家族的鑒定已經(jīng)完成，但關(guān)于其功能驗(yàn)證的研究仍較少。MIKCC類(lèi)型MADS-box基因的大多數(shù)功能已被驗(yàn)證，下一步研究的重點(diǎn)應(yīng)傾向于研究較少的類(lèi)型Ⅰ MADS-box基因。

通過(guò)草莓基因組數(shù)據(jù)庫(kù)可以更好、更快、更全面地了解草莓MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的序列和結(jié)構(gòu)，從而對(duì)其進(jìn)行功能鑒

定和分析，以期驗(yàn)證草莓MADS-box基因家族在花、果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程中的調(diào)控作用。克隆和分離草莓MADS-box基因并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證，探索其在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng)中的調(diào)控作用，將成為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙密珍，王靜，王壯偉，等. 世界草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及江浙滬草莓產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展對(duì)策[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：1-3.

[2]張?chǎng)? 中國(guó)草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與前景思考[J]. 農(nóng)業(yè)展望，2012，8（2）：30-33.

[3]Messenguy F，Dubois E. Role of MADS box proteins and their cofactors in combinatorial control of gene expression and cell development[J]. Gene，2003，316：1-21.

[4]Henschel K，Kofuji R，Hasebe M，et al. Two ancient classes of MIKC-type MADS-box genes are present in the moss Physcomitrella patens[J]. Molecular Biology and Evolution，2002，19（6）：801-814.

[5]Kaufmann K，Melzer R，Theissen G. MIKC-type MADS-domain proteins：structural modularity，protein interactions and network evolution in land plants[J]. Gene，2005，347（2）：183-198.

[6]Parenicová L，De F S，Kieffer M，et al. Molecular and phylogenetic analyses of the complete MADS-box transcription factor family in Arabidopsis：new openings to the MADS world[J]. The Plant Cell，2003，15（7）：1538-1551.

[7]Arora R，Agarwal P，Ray S，et al. MADS-box gene family in rice：genome-wide identification，organization and expression profiling during reproductive development and stress[J]. BMC Genomics，2007，8：242.

[8]Weigel D，Meyerowitz E M. The ABCs of floral homeotic genes[J]. Cell，1994，78（2）：203-209.

[9]Ma H，Depamphilis C. The ABCs of floral evolution[J]. Cell，2000，101（1）：5-8.

[10]Shulaev V，Sargent D J，Crowhurst R N，et al. The genome of woodland strawberry（Fragaria vesca）[J]. Nature Genetics，2011，43（2）：109-116.

[11]Tian Y，Dong Q，Ji Z，et al. Genome-wide identification and analysis of the MADS-box gene family in apple[J]. Gene，2015，555（2）：277-290.

[12]董慶龍，冀志蕊，遲福梅，等. 蘋(píng)果MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)及其在不同組織中的表達(dá)[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（6）：1151-1161.

[13]董慶龍，王海榮，安淼，等. 蘋(píng)果NADP依賴(lài)的蘋(píng)果酸酶基因克隆、序列和表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（9）：1857-1866.

[14]張春華，上官凌飛，俞明亮，等. 桃NAC基因家族生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，30（2）：406-414.

[15]葛安靜，張春華，董清華，等. 草莓SBP基因家族生物信息學(xué)初步分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（13）：215-220.

[16]Leseberg C H，Li A，Kang H，et al. Genome-wide analysis of the MADS-box gene family in Populus trichocarpa[J]. Gene，2006，378：84-94.

[17]Díaz R J，Lijavetzky D，Martínez Z J M，et al. Genome-wide analysis of MIKCC-type MADS box genes in grapevine[J]. Plant Physiology，2009，149（1）：354-369.

[18]Hu L，Liu S. Genome-wide analysis of the MADS-box gene family in cucumber[J]. Genome，2012，55（3）：245-256.

[19]Fan C M，Wang X，Wang Y W，et al. Genome-wide expression analysis of soybean MADS genes showing potential function in the seed development[J]. PLoS One，2013，8（4）：e62288.

[20]Xu Z，Zhang Q，Sun L，et al. Genome-wide identification，characterisation and expression analysis of the MADS-box gene family in Prunus mume[J]. Molecular Genetics and Genomics，2014，289（5）：903-920.

[21]Duan W K，Song X M，Liu T K，et al. Genome-wide analysis of the MADS-box gene family in Brassica rapa（Chinese cabbage）[J].Molecular Genetics and Genomics，2014，290（1）：239-255.郭琳，鐘金城，柴志欣，等. 西藏牦牛NGB基因克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：26-30.