成人和兒童金黃色葡萄球菌感染分子流行病學研究

袁　挺，　應春妹

(1. 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海 200127;

2. 上海復旦大學醫學院附屬婦產科醫院檢驗科，上海 200011)

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成人和兒童金黃色葡萄球菌感染分子流行病學研究

袁挺1，應春妹2

(1. 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海 200127;

2. 上海復旦大學醫學院附屬婦產科醫院檢驗科，上海 200011)

摘要：目的研究上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院(簡稱上海仁濟醫院)及上海兒童醫學中心分離的金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)的分子流行病學特征及藥物敏感性狀況，為臨床合理用藥提供依據。方法收集2012年上海仁濟醫院分離的313株金葡菌和上海兒童醫學中心分離的153株金葡菌，采用多位點序列分型(MLST)、葡萄球菌蛋白A spa基因分型和葡萄球菌染色體mec基因(SCCmec)分型技術進行分子生物學分型，對其中的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)進行SCCmec分型；采用紙片擴散法對金葡菌進行藥物敏感性分析。結果2012年上海仁濟醫院313株金葡菌有42.49%來自痰樣本，其中MRSA 173株，檢出率為55.27%；MLST結果MRSA以ST5型為主；spa基因分型結果以t002型最多，為90株，占MRSA的52.02%，其次為t030型(42株，24.28%)；SCCmec分型結果以Ⅱ型為主。上海兒童醫學中心153株金葡菌有62.09%來自痰樣本，其中MRSA 33株，檢出率為21.57%；MLST結果MRSA以ST59型為主；spa基因分型結果以t437型最多，為14株，占MRSA的42.42%，其次為t002型(5株，15.15%)及t316型(4株，12.12%)；SCCmec分型結果以Ⅳ型為主。 藥物敏感性試驗結果顯示上海仁濟醫院和上海兒童醫學中心金葡菌對萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺及替加環素5種抗菌藥物100%敏感，對其他抗菌藥物耐藥率比較高。上海兒童醫學中心MRSA對環丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、克林霉素、利福平、慶大霉素的敏感性均明顯高于仁濟醫院MRSA(P<0.01)，對頭孢唑啉及紅霉素的敏感性差異無統計學意義(P>0.01)。結論2012年上海仁濟醫院MRSA以ST5-t002-Ⅱ為主，上海兒童醫學中心MRSA以ST59-t437-Ⅳ為主。相比于甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)，MRSA的克隆型別相對集中，更容易引起醫院內的傳播。MRSA在金葡菌中的分離率較高，臨床應根據藥物敏感性試驗結果合理使用抗菌藥物。

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)廣泛分布于自然界中，是人體皮膚黏膜的常見定植菌群，主要引起化膿性感染，包括蜂窩織炎、傷口化膿、氣管炎、偽膜性腸炎、膿胸、膿毒血癥和中毒性休克綜合征等。金葡菌感染可分醫院獲得性和社區獲得性，是醫院感染和社區感染的重要病原菌。樣本送檢距患者入院時間48 h外為醫院獲得性感染，門診樣本或樣本送檢距患者入院時間48 h內為社區獲得性感染。耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)于1961年由JEVONS首次發現，是引起醫院感染的重要病原菌之一。自我國在20世紀70年代發現第1株MRSA后，其分離率在我國迅速上升。該菌對目前臨床上使用的大多數抗菌藥物有很高的耐藥性，并可對β-內酰胺類(包括頭孢菌素、含酶抑制劑復合抗菌藥物以及碳青霉烯類藥物)耐藥。由于MRSA可通過接觸等多種途徑傳播而引起流行，故世界各國均將MRSA的流行情況作為長期監測的重點[1-2]。研究臨床分離金葡菌的分子流行病學特征及藥物敏感性狀況，對于醫院感染的監測和控制以及臨床治療中的合理用藥具有十分重要的意義[3]。我們對2012年上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院(簡稱上海仁濟醫院)及上海兒童醫學中心金葡菌的分離情況及耐藥性進行了調查。

材料和方法

一、菌株來源

收集2012年上海仁濟醫院分離的313株金葡菌(其中醫院獲得性289株，占92.33%)和上海兒童醫學中心分離的153株金葡菌(其中醫院獲得性20株，占13.07%)，排除同一患者同一部位分離到的菌株。樣本類型包括痰、分泌物、全血、咽拭子、尿液、膿液和穿刺液等。

二、試劑與儀器

1. 菌株與試劑標準菌株金葡萄(ATCC 25923)、金葡萄(ATCC 29213)購于衛生部臨床檢驗中心；水解酪蛋白胨瓊脂平板、血瓊脂平板均購自英國OXOID公司。

2. 儀器全自動微生物分析系統(BD公司，美國)，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(PE公司，美國)。

三、方法

1. 菌種鑒定按《全國臨床檢驗操作規程》第3版標準進行接種和培養。將培養于血瓊脂平板上18～24 h的細菌進行革蘭染色鏡檢、觸酶試驗、試管法血漿凝固酶試驗等初步鑒定，全自動微生物分析系統鑒定為金葡菌。

2. MRSA鑒定將新鮮培養的金葡菌用無菌生理鹽水配制成0.5麥氏濁度的菌懸液，無菌棉簽蘸取菌懸液均勻涂布于厚度為4 mm 的水解酪蛋白胨瓊脂平板上，待水分被吸收后，分別將苯唑西林和頭孢西丁紙片貼于瓊脂表面。頭孢西丁含量為30 μg/片，置35 ℃孵育18 h，結果判定標準：頭孢西丁抑菌圈直徑≤21 mm為耐藥，≥22 mm為敏感。苯唑西林為1 μg/片，在35 ℃孵育24 h，結果判定標準: 苯唑西林抑菌圈直徑≤10 mm為耐藥，≥13 mm為敏感。2種藥物中有任一結果為耐藥，則菌株對苯唑西林耐藥，即為MRSA。

3. 分子流行病學分析(1)多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)：MLST是基于7個相距一定距離，且基本覆蓋整個染色體管家基因的核酸序列對金葡菌菌株進行的分型方法。PCR參照ENRIGHT等[4]方法進行，測序結果在MLST官方網站數據庫(http://www.mlst.net)中進行比對分析，確定序列型(sequence type, ST)。(2)葡萄球菌蛋白Aspa基因分型：該分型是一種基于葡萄球菌A蛋白基因的X區重復序列多態性的一種分析方法。PCR參照官方網站的方法進行(http://www.ridom.de/spaserver)，在官方網站根據串聯重復序列特征確定型別。(3)葡萄球菌染色體mes基因(staphylococcal cassette chromosomemec, SCCmec)分型：MRSA攜帶的mecA基因位于葡萄球菌染色體盒mec上，利用多重PCR對SCCmec特異性靶序列進行擴增，根據擴增產物的長度及組合確定SCCmec型別[5]。

4. 體外藥物敏感性試驗本研究選用的14種藥物敏感性紙片即頭孢西丁、環丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺、替考拉寧、萬古霉素、去甲萬古霉素、紅霉素、克林霉素、利福平、慶大霉素、頭孢唑啉和替加環素均購自英國OXOID公司。采用紙片擴散法檢測金葡菌對抗菌藥物的敏感性，按美國臨床實驗室標準化協會(the Clinical and Laboratory Standards Institution，CLSI) M100-S19文件[6]規定的標準進行結果判定。質控菌株為金葡萄 (ATCC 25923)和金葡菌(ATCC 29213)。

四、統計學方法

分子生物學分型的結果按照國際通用方法命名。MLST方法為“ST”+“型別名稱(1～4位阿拉伯數字)”；spa基因分型方法為“t”+“型別名稱(3～4位阿拉伯數字)”；SCCmec使用羅馬數字命名，如Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。在MRSA中，使用“MLST 型-spa型-SCCmec型”進行型別的綜合命名與分析；甲氧西林敏感金葡菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)中以“MLST型-spa型”進行綜合命名。藥物敏感性試驗結果采用WHONET5.6軟件進行統計學分析。結果以2010年CLSI標準進行判斷[7]。組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、樣本分布及構成

菌種經全自動微生物鑒定藥物敏感性分析儀鑒定均為金葡菌，其中上海仁濟醫院金葡菌313株， MRSA 173株，檢出率為55.27%。上海兒童醫學中心金葡菌153株，MRSA 33株，檢出率為21.57%。二者MRSA檢出率差異有統計學意義(χ2=24，P<0.01)。感染的樣本來源廣泛，上海仁濟醫院和上海兒童醫學中心均以痰樣本最多，分別占各自金葡菌樣本來源的42.49%和62.09%，見圖1。

二、MLST分型

MLST結果顯示，上海仁濟醫院313株金葡菌中共發現24種ST，其中7株未分型；173株MRSA僅有3種ST，其中ST5最多，為100株(57.80%)，見表1；140株MSSA中共發現22種ST，主要型別見表2。上海兒童醫學中心153株金葡菌中共發現15種ST型，其中24株未分型；33株MRSA僅有3種ST，其中ST59 最多，為22株(66.67%)，見表3；120株MSSA中共發現13種ST，見表4。

圖1　上海仁濟醫院和兒童醫學中心樣本來源及比例

三、spa基因分型

仁濟醫院MRSA中共發現8種型別，其中t002型最多，為90株(52.02%)，見表1。MSSA中共發現28種spa型別，主要型別見表2。兒童醫學中心MRSA中共發現11種型別，其中t437型最多，為14株(42.42%)，見表3。MSSA中共發現27種spa型，主要型別見表4。

四、SCCmec分型

對上海仁濟醫院173株MRSA進行SCCmec分型，共發現3種SCCmec型，分別為Ⅱ型100株(57.80%)、Ⅲ型65株(37.58%)、Ⅳ 型8株(4.62%)，見表1。上海兒童醫學中心33株MRSA SCCmec分型分別為Ⅱ型8株(24.24%)、Ⅲ型3株(9.09%)、Ⅳ 型22株(66.67%)，見表3。SCCmec分型與MLST結果具有一致性：所有ST239型菌株均為SCCmecⅢ型，ST5型菌株均為SCCmecⅡ型，ST59型菌株則為SCCmecⅣ型。

五、藥物敏感性試驗

上海仁濟醫院和兒童醫學中心MRSA均對萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺及替加環素5種抗菌藥物100%敏感，對其他抗菌藥物的耐藥率均比較高，MRSA的耐藥率明顯高于MSSA。上海兒童醫學中心MRSA對環丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、克林霉素、利福平、慶大霉素的敏感性均明顯高于上海仁濟醫院(P<0.01)，對頭孢唑啉及紅霉素的敏感性差異無統計學意義(P>0.01)。MSSA對抗菌藥物敏感性差異無統計學意義(P>0.01)。見表5、表6。

表1　上海仁濟醫院173株MRSA的分子生物學分型

表2　上海仁濟醫院140株MSSA的分子生物學分型

表3　上海兒童醫學中心33株MRSA的分子生物學分型

表4　上海兒童醫學中心120株MSSA的分子生物學分型

表5　上海仁濟醫院和上海兒童醫學中心MRSA對常用抗菌藥物的耐藥率比較

表6　上海仁濟醫院和上海兒童醫學中心MSSA對常用抗菌藥物的耐藥率比較

續表6

討論

金葡菌是臨床常見革蘭陽性球菌，從20世紀60年代首株MRSA感染病例出現以來，MRSA以驚人的速度在全球范圍內廣泛傳播，成為醫院感染中重要的病原菌[8-11]。金葡菌可引起侵襲性疾病，如皮膚軟組織等局部感染和肺炎、心內膜炎等內臟器官感染以及菌血癥等全身化膿性感染。金葡菌能產生多種毒素，引起急性胃腸炎、燙傷樣皮膚綜合征和中毒性休克綜合征，這些毒素性疾病常發生于兒童，病死率明顯高于成人[12]。MRSA在兒童可造成皮膚壞死性損害，如蜂窩織炎及膿腫等，很多都需要外科干預[13]，也可引起致死性肺炎和敗血癥等重癥感染[14]。由社區獲得性MRSA引起的壞死性肺炎是兒童社區獲得性MRSA感染死亡的主要原因[15]。隨著各類抗菌藥物的臨床廣泛應用，MRSA的分離率也隨之顯著升高，臨床治療十分困難[16]。我國細菌耐藥性監測網2011年的數據顯示，MRSA平均分離率為50.6%[17]，本研究2012年收集的上海仁濟醫院金葡菌MRSA的分離率為55.27%，高于全國水平；上海兒童醫學中心的分離率為21.57%，低于全國水平。二者差異具有統計學意義(P<0.01)。可能原因為上海仁濟醫院分離的金葡菌絕大多數為醫院獲得性的，上海兒童醫學中心醫院獲得性金葡菌較少，而醫院獲得性金葡菌分離者絕大多數具有反復、長期抗菌藥物使用史，使得醫院獲得性MRSA分離率明顯高于社區獲得性MRSA。

金葡菌的分子生物學分型有助于判斷菌株的親緣關系，對醫院內MRSA的感染控制具有重要意義。目前主要的分型方法有脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、MLST、spa基因分型和SCCmec分型。其中PFGE的分辨率最高，但需要特殊的儀器，操作復雜、耗時，并且缺乏實驗室間的可比性，因此不適用于長時間、大規模的監測[18]。相比之下，MLST、spa基因分型在國際范圍內已有標準、統一的操作方法及命名體系，能夠實現在不同實驗室、地區甚至國家之間的對比，適于研究群體生物性和長期大范圍、全球性的流行病學調查研究。2種方法分型結果具有相關性，但spa基因分型的分辨率更高[4，18]。SCCmec基因分型基于決定對甲氧西林及其他相關藥物耐藥的耐藥基因盒，因此僅適用于MRSA的分型，并且分辨率是最低的。在全世界范圍內僅發現11種不同的SCCmec型別[19]。本研究顯示上海仁濟醫院MRSA MLST結果以ST5為主，上海兒童醫學中心以ST59為主。spa基因分型結果上海仁濟醫院MRSA以 t002型最多，為90株，占MRSA的52.02%，其次為t030(42株，24.28%)；上海兒童醫學中心MRSA以t437型最多，為14株，占MRSA的42.42%，其次為t002型(5株，15.15%)及t316型(4株，12.12%)。 SCCmec分型結果上海仁濟醫院以Ⅱ型為主，上海兒童醫學中心以Ⅳ型為主。有報道，醫院獲得性MRSA通常攜帶SCCmecⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型中的一種，而社區獲得性MRSA則攜帶Ⅳ 型或Ⅴ型[20]，本研究與其基本一致。

藥物敏感性試驗顯示MRSA耐藥廣泛，不僅對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，而且還對大環內酯類、四環素類等常用抗菌藥物普遍耐藥。本研究未發現對萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺、替加環素耐藥的金葡菌。上海兒童醫學中心MRSA對環丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、克林霉素、利福平、慶大霉素敏感性均明顯高于上海仁濟醫院(P<0.01)，對頭孢唑啉及紅霉素敏感性差異無統計學意義(P>0.01)，可能與Ⅳ型除了攜帶有mecA基因外不攜帶其它的耐藥基因，所以耐藥性不高有關[21-24]。此外還有一個重要原因，上海兒童醫學中心在為兒童選用抗菌藥物方面考慮到兒童身體發育不完全，堅持盡量少用抗菌藥物，盡量用低等級抗菌藥物，盡量不聯合用藥的原則，從而保證了兒童的用藥安全，減少了耐藥菌的產生。而在成人用藥方面目前我國做得尚有欠缺，應根據藥物敏感性試驗結果合理選用抗菌藥物。隨著臨床藥物的頻繁使用，國外已出現對糖肽類抗菌藥物敏感性降低MRSA感染的報道[25]，給臨床選用抗菌藥物進行有效治療帶來巨大壓力。因此，對于該類抗菌藥物的使用更應慎重，以延緩和減少耐藥菌株的產生。

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關鍵詞：金黃色葡萄球菌；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；藥物敏感性試驗；分子生物學分型；流行病學分析

Molecular epidemiology research ofStaphylococcusaureusinfection from adult and child patientsYUANTing1,YINGChunmei2. (1.DepartmentofClinicalLaboratory,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiObstetricsandGynecologyHospital,FudanUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the molecular epidemiology characteristic and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus (S. aureus) isolated from Renji Hospital affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine (Shanghai Renji Hospital) and Shanghai Children′s Medical Center in order to provide reference for the rational use of clinical medication. MethodsIn 2012, 313 S. aureus isolated from Shanghai Renji Hospital and 153 S. aureus isolated from Shanghai Children′s Medical Center were collected and analyzed by multilocus sequence typing (MLST) and Staphylococcus protein A spa gene typing. In addition, staphylococcal cassette chromosome mec(SCCmec) typing was performed for methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA). Antimicrobial susceptibility test was detected by Kirby-Bauer method. ResultsThere were 313 isolates of S. aureus isolated from Shanghai Renji Hospital in 2012, mainly isolated from sputum, accounting for 42.49%, 173 isolates were MRSA, and the detection rate was 55.27%. The predominant type of MLST was ST5. The predominant type of spa gene typing was t002(90 isolates, 52.02%), and next type was t030(42 isolates， 24.28%). The predominant type of SCCmec typing was Ⅱ. There were 153 isolates of S. aureus isolated from Shanghai Children′s Medical Center, mainly isolated from sputum, accounting for 62.09%, 33 isolates were identified as MRSA, and the detection rate was 21.57%. The predominant type of MLST was ST59. The predominant type of spa gene typing was t437(14 isolates, 42.42%), and next type was t002(5 isolates, 15.15%) and t316(4 isolates, 12.12%). The predominant type of SCCmec typing was Ⅳ. The antimicrobial susceptibility test showed that all the S. aureus isolates were 100% sensitive to vancomycin, norvancomycin, teicoplanin, linezolid and tetracycline, and drug resistance rate was obviously lower than others. The drug resistance rates of MRSA from Shanghai Children′s Medical Center to ciprofloxacin, moxifloxacin, levofloxacin, clindamycin, rifampicin and gentamicin were significantly higher than those from Shanghai Renji Hospital(P<0.01).For cefazolin and erythromycin, there was no statistical significance(P>0.01). ConclusionsThe type of ST5-t002-Ⅱis the major epidemic MRSA type in Shanghai Renji Hospital, and ST59-t437-Ⅳ is the major epidemic MRSA type in Shanghai Children′s Medical Center in 2012.Unlike methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA), MRSA shows clustered clonal types, suggesting a nosocomial spread in hospital. The isolation rate of MRSA in S. aureus is high. Clinic should rationally use antimicrobial agents according to the results of drug susceptibility.

Key words:Staphylococcus aureus; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Antimicrobial susceptibility test; Molecular biology typing; Epidemiology analysis

收稿日期：(2015-03-07)

通訊作者：應春妹, 聯系電話：021-63455050-8394。

作者簡介：袁挺，男，1980年生，碩士，主管技師，主要從事細菌耐藥機制研究。

中圖分類號：(本文編輯：姜敏)

文章編號：1673-8640(2015)11-1119-06R378.1 1673-8640(2015)11-1125-03R446.1

文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.014 ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.015