RNA干擾技術的研究進展

張　鑫　郝玉琴

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·綜述·

RNA干擾技術的研究進展

張鑫1，2郝玉琴1

RNA干擾技術具有高特異性、高效性等顯著優勢，近年在醫學領域廣泛應用，包括基因組研究、病毒性疾病治療、腫瘤治療、自身免疫性疾病治療及新藥開發等。本文就RNAi技術的研究現狀作一綜述。

RNA干擾技術；醫學應用前景

2002年12月20日，RNA干擾(RNA interference，RNAi)被science雜志評為年度十大科技成就之首，Nature雜志亦將siRNA評為年度重大科技成果之一。RNAi 作為一門新興技術以其高特異性、高效性等顯著優勢成為研究基因功能的全新手段，其在生物醫學領域有著廣闊的應用前景。

1　RNAi發展背景

1990年，Jorgensen試圖在矮牽牛花中插入一種色素基因，希望能使花朵的顏色變得更深，結果卻得到了白色花朵的矮牽牛花，當時他把這一現象稱為共抑制[1]。1994年Cogoni 在真菌中發現同種現象,被其稱為基因壓制[2]。1995年，Guo等[3]用反義RNA技術阻斷線蟲par-1基因的表達時，發現正義RNA具有與反義RNA同樣可以抑制該基因表達的作用。1998年Fire等[4]發現將dsRNA注入線蟲體內后可抑制序列同源基因的表達，遂將這種現象命名為RNA干擾(RNA interference)，簡稱RNAi。2001年Elbashir等[5]用siRNA率先在哺乳動物培養的細胞中誘導特異性基因沉默，從而開始了RNAi 技術在哺乳動物細胞中的研究應用。2002年，Brummelkamp等首次成功構建了小發夾RNA( small hairpin RNA，shRNA)表達載體，并發現轉染該載體可特異性、有效地降低目的基因表達，為RNAi 技術在基因治療中的應用研究奠定了基礎[6]。

2　RNA干擾技術原理及特點

2.1RNAi包括兩個階段分別為起始階段和效應階段。在RNAi起始階段中，加入的小分子RNA被切割成21-23 bp長的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNA，siRNA)。Dicer酶是RNAseIII家族中特異性識別雙鏈RNA的成員之一，它可以以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入的或是由轉基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA(dsRNA)，將RNA降解為21-23bp的siRNA雙鏈，并且每個片段的3'端都有2個突出的堿基。在效應階段，siRNA雙鏈結構結合一個核酶復合物，形成了RNA誘導的沉默復合物(RNAinduced silencing complex，RISC)。其正義鏈被釋放出來后，反義鏈將作為引導鏈與靶mRNA作用。激活RISC需要一個ATP，激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄體上，并且在距離siRNA 3'端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但是每個RISC都含有一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶[7]。

2.2RNAi的特點RNAi較反義寡核苷酸核酶、基因敲除等技術有著無可比擬的特點和優勢：(1)高效性:少量的siRNA可以顯著抑制目的基因的表達,具有催化放大效應；(2)高特異性:RNAi只降解同源mRNA，而其他mRNA的表達則不受影響；(3)傳播性:RNAi具有強大的細胞穿透力，抑制效應可以穿過細胞界限，干擾效應可遺傳給后代；(4)ATP依賴性:RNAi的發生依賴于ATP的參與，因為在Dicer酶將dsRNA切割成siRNA過程及RISC過程均需要ATP的參與。

3　RNA干擾的方法及載體

3.1RNA干擾的方法目前RNA干擾的方法最常用的是直接轉染siRNA和構建shRNA載體。目前獲得siRNA主要有三種方法，化學合成、體外酶法合成和體內轉錄。因siRNA 相對分子量較小，在血漿中半衰期較短，極不穩定，siRNA在體內作用時間短，使其應用受到限制。shRNA是一段具有緊密發卡環的RNA序列，通過載體將克隆其編碼的DNA導入細胞，在細胞中，shRNA被加工成siRNA，發揮抑制特異mRNA表達的作用,這種裝載了shRNA的載體可以通過篩選穩定傳遞到子代細胞中去[8]。載體介導shRNA表達技術能長期和穩定地抑制靶基因的表達，這使不能持久抑制基因表達的問題迎刃而解，可用來構建理想的實驗細胞模型，與化學合成siRNA法相比具有更大的應用潛力，因此shRNAs表達載體技術成為腫瘤基因治療的強大工具。

3.2RNA干擾的載體載體是引入外源性基因不可或缺的重要工具，如何設計和構建能夠跨細胞內外生理屏障，實現較高轉染效率并具有低細胞毒性的基因載體系統一直是基因治療領域的研究重點。目前基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體。

3.2.1病毒載體病毒載體易于制備、純化、濃縮，且具有宿主范圍廣、感染率高、理化性質穩定、不整合宿主基因組等優點，因此，使用頻率較高。其中應用較多的為逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體。

逆轉錄病毒載體主要來源于莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)，它能穩定的整合進宿主細胞中，但是只能感染增殖細胞中而不能有效地轉導非增殖細胞。

腺病毒載體優點在于導入效率高，對增殖或非增殖細胞均可感染，載體包裝能力強、細胞毒性反應低等優點。但還存在著外源基因表達的可控性差，無靶向性也可引起機體的免疫反應等。

慢病毒載體感染效率很高，且感染后整合穩定，慢病毒也可以感染分裂期和不分裂細胞[9]，如肌纖維細胞、神經細胞等。與逆轉錄病毒載體和腺病毒載體比較, 具有高效整合、高效轉錄、高效表達和宿主范圍廣的特點,因此成為當前基因治療和轉基因動物中載體研究的熱點。

3.2.2非病毒載體近年來，非病毒載體受到關注，其原因主要是非病毒載體系統安全性高、負載量大、生物相容性好、便于保存和檢驗等優勢。目前在介導RNAi研究中較常用的非病毒載體主要有：陽離子脂質體轉染效率相對較高，毒副作用較大；陽離子細胞穿膜肽生物降解性好，負載率尚有不足；樹枝狀大分子負載量大，轉染效率不高；陽離子聚合物載體種類繁多，以聚乙烯亞胺為例，負載量大、轉染效率較高、毒性大；納米無機材料負載量大、毒性低、生物相容性好，但是轉染效率有待提高[10]。納米粒子作為非病毒載體，已被廣泛用于RNAi技術的效應分子小分子干擾RNA的遞送[11]。但納米載體的設計仍然相當困難，DNA與納米粒子的結合技術非常復雜，開發安全、高效、靶向的納米基因轉運載體任重而道遠。

4　RNA干擾技術的應用

4.1基因功能研究的應用目前的研究是通過抑制某基因的表達來闡述該基因功能，通過RNAi特異性地抑制基因的表達來闡明基因在生物體中的功能，較傳統方法如基因敲除省時方便。隨著人類基因組測序計劃的完成，研究已經進入后基因組時代，基因組學的重心已由結構基因組學轉向功能基因組學。RNAi技術以其高度特異性、高效性、操作簡單等特點，成為研究基因功能的重要工具。許多研究工作者通過 RNAi 技術對人類基因組進行逐一“敲除”，并將細胞或者組織的表現記錄下來，建立一個人類RNAi文庫，為后續研究提供基礎[12]。

4.2抗病毒治療的應用RNAi是生物體內廣泛存在的一種古老的基因水平的免疫監控機制，用以對抗病毒感染[13]。目前，借助RNAi技術治療病毒感染性疾病仍然是其主要的應用研究領域。HIV感染目前還缺乏有效的疫苗和治療方法，RNA干擾技術的問世，為HIV感染者帶來新的希望。有學者[14]通過構建一株包含CCR5 shRNA、人類/獼猴TRIM 5α基因和核仁內反式激活反應元件類似物的慢病毒載體，感染了該重組慢病毒的CD34+造血干細胞在人源化免疫缺陷小鼠體內可以分化為HIV-1抗性的CD4+T細胞，這為HIV感染者的治療提供了理論基礎。此外RNAi 技術已經廣泛應用于病毒基因的轉錄后調節，并且已經成功抑制了多種病毒的復制，如乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)[15]、丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)[16]、流感病毒(influenza virus A)[17]等。

4.3抗腫瘤治療的應用腫瘤基因治療的安全性、有效性及特異性的特點，使近年來受到越來越多的關注，并且取得了突出的研究成果。Zhen等[18]構建了靶向survivin的shRNA載體并轉染神經膠質瘤U251細胞，體外實驗流式細胞儀(Flow cytometry，FCM)分析細胞顯示：細胞有絲分裂發生障礙，凋亡明顯增加。該作者通過建立U251裸鼠移植瘤模型，用survivin-shRNA進行干預，定期觀察并測量腫瘤大小，3周腫瘤體積和重量均明顯低于對照組。實驗還發現survivin-shRNA還可以抑制腫瘤血管的生成。Zhao等[19]用肺癌A549細胞作為研究對象，構建了livin和survivin的shRNA的真核表達載體，實驗研究發現共轉染組對腫瘤細胞的生長抑制和促凋亡作用明顯高于對照組和單轉染組。這些研究成果為RNAi技術在腫瘤治療領域的應用奠定了理論基礎。腫瘤是多個基因相互作用調控的結果，RNAi技術是一項高特異性和高效率的基因沉默技術，且RNAi可同時沉默多個腫瘤相關基因，因此RNAi技術成為目前腫瘤治療方法的研究熱點，其在腫瘤相關基因的功能研究和基因治療方面具有廣闊的應用前景。

4.4在自身免疫性疾病治療中的應用RNAi技術近年來亦被用于自身免疫性疾病的研究,Crispin等[20]用siRNA技術處理系統性紅斑狼瘡(SLE)的T細胞，結果顯示白細胞介素-2(IL-2)的分泌水平得以恢復。而IL-2的減少是SLE 最主要的免疫病理學表現。Wang等[21]通過RNA干擾人類枯草溶菌素轉化酶6(PCSK6)，觀察其對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(RASF)的影響，結果發現抑制RASF增殖、侵襲及轉移，這表明抑制PCSK6可能在類風濕關節炎(RA)的發展起到一定的保護作用。這些研究成果表明，RNAi技術的出現無疑為自身免疫性疾病的治療開辟了新的思路和途徑。

4.5藥物開發及應用利用 RNAi能夠特異高效地抑制基因表達，獲得去基因功能表型，能夠在短時間內大規模篩選靶點，用RNAi技術篩選藥靶和評定藥靶大大縮短了藥物研發時間。Duff等[22]通過RNAi技術減少蛋白轉移酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK 9)的表達，發現能有效降低小鼠血清膽固醇水平，說明沉默PCSK 9可成為治療高膽固醇的藥物靶點。在篩選藥物上，Liu-Sullivan等[23]通過pooled shRNA的方法發現維A酸類藥物能增強PLK1激酶抑制劑藥物GSK461364的抑制作用，進而阻止肺癌細胞有絲分裂，加速肺癌細胞凋亡的速度。癌癥是多基因或多因素作用引起的疾病，靶向單個分子的RNAi藥物通常不能滿足治療需要，因此有必要設計同時抑制疾病相關的多個關鍵基因的多靶siRNA來調控疾病的多個節點[24]。癌癥的治療幾乎是多靶點藥物組合療法，它越來越多地用于艾滋病的預防和治療、腦缺血、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病等[25]。

5　RNA干擾技術的展望

RNAi 沉默機制的高效性、特異性及穩定性使這項技術成為生物醫學領域一次劃時代的革命。它的出現給基因功能研究、生物基因工程、醫藥研究提供了一種全新的方法。雖然RNAi技術在體內外實驗研究中取得了一定的成果，并顯示出良好的應用前景，但在該技術廣泛用于臨床前，仍存在一些問題亟待解決。如如何將siRNA安全有效的導入細胞，并使其在體內穩定表達。siRNA作為藥物應用的主要障礙在于藥物運送系統及給藥方式，開發一個安全高效的運載系統仍是科研工作者和臨床醫師亟待解決的問題。隨著研究的深入我們相信這些問題最終會被解決，RNAi作為一門新興技術正顯示著強大的生命力。該技術將更廣泛地應用于生命科學研究和疾病的臨床治療中,這將是目前無法治療的疾病在基因治療方面的一場新革命。

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(收稿：2015-04-21修回：2015-08-26)

Update of RNA interference technology

ZHANGXin1，2,HAOYuqin1.

1.DepartmentofDermatology,ThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou014010,China; 2.InnerMongoliaMedicalUniversity,Huhhot010000,China

HAOYuqin，E-mail:haoyuqin0472@163.com

RNA interference (RNAi) technology is superiority of the high particularity and efficiency, which is wildly used in medical sciences including genomic research in medicine, viral therapy, the treatment of cancer and autoimmune diseases and new drug development. The update of RNA interference technology was reviewed.

RNA interference technology; medical application prospects

國家自然科學基金資助項目(編號：81260407 )

1內蒙古醫科大學第三附屬醫院皮膚科，包頭，014010

2內蒙古醫科大學，呼和浩特，010000

郝玉琴，E-mail:haoyuqin0472@163.com