高遷移率族蛋白1-HMGB-1：糖尿病視網膜病變中的新面孔

韓辰宇 張 敏?

高遷移率族蛋白1-HMGB-1：糖尿病視網膜病變中的新面孔

韓辰宇 張 敏?

糖尿病視網膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是世界范圍內最主要的致盲眼病之一［1-2］。目前DR的發生機制尚未明確，因此缺少針對病因的有效治療，DR常導致患者進行性的視功能損害甚至完全失明。多年來，眼科學家和內分泌學家主要研究視網膜毛細血管微循環的改變，取得了豐碩的成果。然而，隨著研究的深入和技術手段的不斷更新，有研究者發現，在DR的發生發展中，除有視網膜微血管損害以外，還有進行性的神經組織的退行性變［3］。在此過程中，高遷移率族蛋白1（HMGB-1）作為炎性因子所觸發的網絡式級聯反應不僅參與了視網膜的微血管病變，還通過促進神經膠質細胞活化參與了炎性因子釋放、新生血管形成、血－視網膜屏障破壞和視網膜神經元的損傷，引起視網膜不可逆性的功能障礙。本文就HMGB-1在DR發病中的作用機制作一綜述。

1 HMGB-1

HMGB-1廣泛存在于真核細胞中，是一種含量豐富的高度保守的非組核蛋白。其是一種含有兩極結構的蛋白質，包含兩個同源性的HMG boxes，A和B，分別含有75個氨基酸，HMGB-1的C-端是由酸性氨基酸組成的尾巴，N-端有肝素結合位點，在細胞內具有穩定核酸結構、調節轉錄和基因表達等多種功能。細胞壞死時，與DNA分離的HMGB-1從壞死的細胞中被動釋放，此外，HMGB-1還可以經活化的單核、巨噬細胞，成熟的樹突狀細胞，自然殺傷細胞以及血管內皮細胞主動釋放。細胞外的HMGB-1作為炎性因子觸發一系列的炎癥反應。HMGB-1可以激活多種不同的受體，其中包括糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、Toll樣受體2（toll-like receptor-2，TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）等。在 HMGB-1的結構中，B-box是真正參與炎性反應的部分，其通過與RAGE結合，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、細胞外調節蛋白激酶1、2（extracellular signalregulated kinase 1 and 2，ERK1/2）以及核因子-B（nuclear factor Kappa B，NF-B），改變基因轉錄，上調具有致炎作用的細胞因子、趨化因子以及粘附蛋白的表達，強化細胞內的氧化應激，在DR的血管損傷及神經退行性病變中發揮至關重要的作用。近年來，國內外研究表明：慢性低度的炎癥反應參與了DR的病理過程。而在此過程中，HMGB-1作為炎性介質搭建了持續的炎性損傷與進行性加重的視網膜神經元退行性病變之間的橋梁。

2 RAGE介導的信號通路

RAGE是免疫球蛋白超家族成員，是一種跨膜受體，在一條多肽鏈上含有3個免疫球蛋白樣區域，可以介導信號轉導，通過產生活性氧，激活MAPK及NF-B信號通路（細胞增殖與炎癥）、Ras通路（應激和細胞凋亡）、Rac/Cdc42通路（細胞生長和運動）以及k/Stat通路（基因表達調控） 等，上調多種生長因子、細胞間粘附分子以及炎癥因子等基因的表達，促進細胞增殖，增加血管通透性，導致細胞外基質擴張、血管基底膜增厚、微血管通透性增加、血小板聚集，進而導致毛細血管栓塞，視網膜組織缺血缺氧［4］。對SD糖尿病鼠的研究發現，視網膜膠質細胞RAGE水平上調，而Muller細胞是膠質細胞的主要成員，在糖尿病早期的特征性血管病變以及神經元退行性病變中均起到重要作用，提示RAGE是DR的中心介導因素之一。在DR的進程中，HMGB1主要作用于Muller細胞、神經節細胞（glial cell）以及視網膜色素上皮細胞（Retinal pigment epithelial，RPE）上的RAGE，介導視網膜周細胞的死亡和新生血管的形成、血管內皮連接蛋白-閉合蛋白的數量減少和血-視網膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的損傷、視網膜神經元和神經膠質細胞的退行性變以及神經營養因子的過度消耗。

3 HMGB1介導的周細胞死亡和新生血管形成

在DR的發病機制中，現已形成4條經典的通路，60年代Gabbay等［5］在Science上首先報道了導致DR發病的多元醇通路，70年代發現了非酶糖基化終末產物（AGE）機制［6］，80年代和90年代相繼揭示了蛋白激酶C（PKC）通路［7］以及氨基己糖通路［8］。這4條致病通路的激活將導致細胞內氧化應激的失衡，最終導致視網膜周細胞的死亡和新生血管的形成。然而，大量的基礎和臨床試驗表明，阻斷任何一條通路，均不能延緩DR的發生。因此DR發病機制上一定存在更多因素的相互協同以及上下游因子之間的網絡式級聯式反應［9］。越來越多的基礎和臨床實驗表明，炎癥參與了DR的發生，高血糖引起了細胞應激反應的失衡，促使細胞因子和炎性介質分泌增多，使細胞和組織一直處于一種慢性低度的炎癥反應狀態，從而導致DR中周細胞的死亡和新生血管的形成，在此過程中，HMGB1起到了至關重要的作用。

血管內皮細胞和周細胞是視網膜毛細血管的重要組成部分，而周細胞的死亡是糖尿病視網膜病變中的特征性損傷。在視網膜微血管的周細胞膜上，存在HMGB1受體RAGE的表達［10］，由此可推想，HMGB1作用于周細胞膜RAGE產生的毒性作用能夠導致微血管上周細胞的死亡。然而，基礎實驗表明，用高濃度（10μg/ml）HMGB1作用過的周細胞與用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）（對照組）作用過的周細胞比較，其生存率并無明顯差異。因為視網膜微血管周細胞與視網膜神經節細胞之間存在密切聯系，試驗者進一步探索神經節細胞是否參與HMGB1介導的周細胞的死亡。試驗表明，視網膜神經節細胞介導了HMGB1引發的周細胞死亡［11］。HMGB1作用于視網膜神經節細胞上的RAGE，進而激活p38 MAPK和ERK1/2。MAPK屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶［12］，能被多種物質激活，介導由細胞表面至細胞核內部的信號轉導；ERK1/2也是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶中的一種，但其是脯氨酸特定導向的，只能使脯氨酸相鄰的絲氨酸-蘇氨酸磷酸化，進而產生特定的生物學效應。p38 MAPK和ERK1/2的激活，使NF-B磷酸化，上調炎癥因子ICAM-1、TNF-α、IL-1b、IL-6、MCP-1的表達，導致白細胞釋放多種活性物質入血，視網膜毛細血管血流無灌注。視網膜血管的滲漏和無灌注是早期DR的主要病理表現，幾乎所有的視網膜損害均來源于此兩種病理改變，而HMGB1介導的新生血管形成，正是建立在這兩種改變之上。最新實驗表明，HMGB1可直接作用于很多組織，使新生血管形成，但并不能直接作用于視網膜。2013年，Biscetti及其同事報道，無論是在視網膜下或是玻璃體液中注射HMGB1，所引起的新生血管形成與對照比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。然而，在缺血缺氧狀態下，HMGB1可導致血管內皮生長因子-A（vascular endothelial growth factor，VEGF-A） 表達大幅增加，間接發揮作用。

4 HMGB1介導的Occludin的數量減少和BRB的損傷

血-視網膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）是視網膜組織生理的一個重要組成部分，BRB的通透性分為內向通透性和外向通透性，前者是指物質經屏障進入視網膜，后者是指視網膜內物質經屏障到達視網膜毛細血管腔或脈絡膜組織［13］。生理狀況下，內向通透性明顯低于外向通透性，這是維持視網膜內環境穩態所必需的。BRB由內屏障和外屏障組成。外屏障屬上皮型屏障，由視網膜色素上皮細胞及其連接構成，包括頂部的縫隙鏈接、中部的閉鎖小帶和底部的粘連小帶，其中閉鎖小帶在外屏障中發揮最為重要的作用。內屏障屬內皮型屏障，由視網膜毛細血管內皮細胞及其連接構成。內皮細胞之間由上皮欄連接，分為粘連小帶和閉鎖小帶，前者為上皮欄的大部分；后者位于近管腔側，非常短，但是閉鎖小帶在內屏障中起到關鍵作用。最近的研究顯示：BRB中的閉鎖小帶由獨特的蛋白質裝配完全，其中，Occludin和Claudin這兩種跨膜蛋白的存在限制了大分子物質在內皮細胞之間的流動。Occludin為一種6次跨膜蛋白，其N端和C端均位于視網膜毛細血管內皮細胞內。其C端與胞漿中的ZO蛋白的N端相連，而ZO蛋白的C端又與胞漿中細胞骨架中的肌動蛋白相連。炎性因子作用于視網膜毛細血管內皮細胞上的RAGE，激活p38 MAPK和ERK1/2，使NF-B磷酸化，導致ICAM-1、TNF-a、IL-1b、IL-6、MCP-1等級聯式釋放，使骨架蛋白的穩定性喪失，引起Occludin的移動和重新分布，進而使呈連續形態的細胞間連接變為間斷性，表現為BRB的損傷。研究證明，DR發生時，在視網膜毛細血管內皮細胞連接處，Occludin蛋白數量減少，并重新分布，導致BRB屏障功能的缺失，在此過程中，HMGB1起到了不可替代的作用。

為了證明HMGB1可以介導視網膜毛細血管內皮細胞間連接處閉合蛋白數量的減少，研究者使用定量免疫印跡法測量了糖尿病大鼠、晶狀體內注射HMGB1的糖尿病大鼠、晶狀體內注射PBS的糖尿病大鼠以及正常大鼠視網膜毛細血管中閉合蛋白的數量，結果表明：單純糖尿病大鼠中毛細血管內皮細胞閉合蛋白的數量較正常大鼠下降30%，而晶狀體內注射HMGB1的糖尿病大鼠毛細血管內皮細胞閉合蛋白的數量較晶狀體內注射PBS的糖尿病大鼠下降55%。同時，研究發現，晶狀體內注射HMGB1的正常大鼠，RAGE、NF-B以及炎癥因子ICAM-1和MCP-1的表達均增加，而TLR2和閉合蛋白的表達均下降。由此可以推斷，HMGB1依然是通過RAGE來介導閉合蛋白的數量減少，而非TLR2。

5 HMGB1介導的視網膜神經元及神經膠質細胞退行性變

近年來，與DR相關的基礎和臨床研究結果顯示，在未出現視網膜微血管病理改變之前，即可見神經視網膜的損傷，繼而出現視網膜的功能改變，表現為視網膜電圖中振蕩電位峰值的降低、潛伏時的延遲、a波的波幅降低、暗適應能力減弱、對比敏感度下降、藍黃色覺異常及視野損害等變化［14］。DR早期即可出現視網膜神經節細胞、無長突細胞及視網膜神經膠質細胞的特征性病理改變，主要表現為視網膜無長突細胞的數量減少以及Muller細胞的功能紊亂［15］。Muller細胞的胞體位于內核層，但其突起卻占據從內界膜至外界膜的整個視網膜厚度，甚至越過外界膜形成絨毛纖維，即所謂的纖維欄。Muller細胞作為視網膜的支持細胞，其突起包纏著大部分神經細胞，為神經細胞提供營養物質。電鏡下，與其周圍細胞比較，Muller細胞的胞質中包含許多發育良好的纖維，纖維的走形方向不定，但貼近細胞膜表面，大致方向與細胞膜平行，使Muller細胞的突起形成許多環狀結構，將神經細胞的突起包繞，視網膜中的毛細血管大部分也被Muller細胞的突起所包繞。因此，在視網膜特異性的“神經—血管耦連”中，Muller細胞起到了不可或缺的作用，在維持視網膜的生理功能上扮演著“代謝共生”的角色。病理狀態下，HMGB1等炎癥因子的激活可引起Muller細胞的反應性膠質化增生，即Muller細胞的活化。而Muller細胞的活化對視網膜神經元、毛細血管內皮細胞以及其他的視網膜神經膠質細胞、視網膜色素上皮細胞、光感受器細胞等細胞的功能既存在修復作用，又存在損傷的可能。

HMGB1作為炎性因子如何介導DR神經退行性變目前尚無定論，近幾年的基礎研究證明：晶狀體內注射HMGB1，可使視網膜中活化的caspase-3和谷氨酸（glutamate）表達上調，而酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、谷氨酰胺合成酶（glutamine syn- thetase，GS）、和乙二醛酶1（glyoxalase 1，GLO 1）的表達和活性下降。這為HMGB1引起的神經損傷機制提供了新的思路：（1）HMGB1可以激活caspase-3，導致無長突細胞死亡。caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細胞毒性T淋巴細胞（CTL）殺傷機制的重要組成部分。DR早期，HMGB1可誘導caspase-3的激活，使無長突細胞數量減少，而TH作為無長突細胞的特有標志物，在晶狀體內注射HMGB1的小鼠視網膜中表達下降，證實了無長突細胞減少的結果。（2）HMGB1可使視網膜內谷氨酸含量增加。谷氨酸是大腦和視網膜的主要興奮性氨基酸，然而，多項研究表明，DR中谷氨酸穩態失調，視網膜細胞外的谷氨酸毒性水平增加，細胞外的谷氨酸誘導激活N-甲基-D天門冬氨酸（NMDA）受體，致大量鈣離子和鈉離子進入細胞內，誘導細胞死亡。HMGB1可作用于視網膜Muller細胞，使GS的活性下降，而在視網膜中，Muller細胞是唯一具有GS的細胞，并能表達具備高親和力的谷氨酸轉運體，通過GS將谷氨基酸轉化為谷氨酰胺，降低谷氨酸濃度，解除對神經元的毒性作用。此外，HMGB1還可以促進谷氨酸從神經膠粒（gliosomes）中釋放，而從神經膠粒中釋放的谷氨酸又可以進一步促進HMGB1的表達，這種正反饋機制加重了谷氨酸所引起的細胞毒作用。（3）HMGB1可使GLO1活性減低，增加體內糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）的數量。AGEs為葡萄糖通過非酶糖基化作用與大分子物質形成的不可逆性交聯共價產物，在持續高血糖環境中，葡萄糖通過非酶化反應與蛋白質中氨基酸等相互作用形成Schiff失衡堿，后者進一步發生分子結構重排，產生較穩定的Amadori產物，并最終形成復雜的AGEs。DR中，AGEs可致視網膜周細胞損傷。丙酮醛（MG）是AGEs的前體物質，在細胞內可轉化為AGEs。此外，MG還可以調節共阻遏子mSm3A的活性，從而增加血管緊張素2的表達，使血管緊張素2系統的活性增高。促進周細胞從血管內皮的分離和遷徙，最終導致糖尿病視網膜周細胞的丟失。GLO1可消除體內MG，抑制細胞內AGEs的生成，起到解毒作用。HMGB1可使體內GLO1的活性下降，導致體內MG和AGEs數量增加，加速DR的進展。（4）HMGB1使體內神經營養因子過度消耗。視網膜包含大量的神經元及神經膠質細胞，能夠產生腦源性神經營養因子（BDNF）、色素上皮衍生因子（PEDF）等神經營養因子。神經營養因子在神經元、神經膠質細胞的功能維持方面起著重要的作用。BDNF由視網膜神經節細胞（RGCs）、Muller細胞產生，作用于酪氨酸激酶受體（Tr-B），其效應主要依賴BDNF與受體結合的親和力及受體激活后下游信號的級聯反應來實現。在缺氧條件下BDNF通過增加Muller細胞對谷氨酸的攝取及上調GS的表達從而發揮神經保護作用。近年來，研究者發現，Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者體內血清BDNF含量與HMGB1呈極強的負相關關系，由此可知，HMGB1可能介導了BDNF的耗竭，導致神經元和神經膠質細胞的退行性變，加速了DR的進展。

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201700 復旦大學附屬中山醫院青浦分院內分泌科

*通信作者