股骨頭壞死患者壞死骨組織中miRNA表達譜變化

楊玉寶，劉洪亞，闞金慶，高忠禮，李林(山東醫學高等專科學校附屬醫院，山東臨沂76000;臨沂市人民醫院;吉林大學中日聯誼醫院;延邊大學附屬醫院)

股骨頭壞死患者壞死骨組織中miRNA表達譜變化

楊玉寶1，劉洪亞1，闞金慶2，高忠禮3，李林4
(1山東醫學高等專科學校附屬醫院，山東臨沂276000;
2臨沂市人民醫院;
3吉林大學中日聯誼醫院;4延邊大學附屬醫院)

摘要:目的觀察股骨頭壞死患者壞死骨組織中miRNA表達譜變化，探討miRNA在股骨頭壞死發生發展中的作用。方法選擇正常股骨粗隆間骨折(對照組)、股骨頭壞死(觀察組)患者各4例，分別取正常及壞死股骨頭骨組織，采用基因芯片技術檢測miRNA表達譜變化;經聚類分析尋找明顯上調和下調的基因，以RT-PCR法檢測其表達量。結果兩組采用miRNA芯片檢測426個miRNA，上調比例≥2的有2條(hsa-miR-494-st和hsa-miR-29a-st)，下調比例≤0.5的有1條(hsa-miR-486-5p-st)。觀察組hsa-miR-29a-st的相對表達量為3.56±5.02，對照組為1.16 ±0.15，兩組比較，P＜0.05;觀察組hsa-miR-494-st、hsa-miR-486-5p-st的相對表達量分別為2.32±1.42、1.85± 1.24，對照組分別為4.13±3.18、3.78±2.69，兩組比較，P均＞0.05。結論股骨頭壞死患者壞死骨組織中存在miRNA表達譜變化，其中hsa-miR-29a-st可能在股骨頭壞死發生、發展過程中起調控作用。

關鍵詞:缺血壞死性股骨頭;microRNA;聚合酶鏈反應;基因芯片

股骨頭壞死是一種難治性疾病，其發病機制目前尚不清楚。股骨頭壞死一般自死骨邊緣和周圍活組織結合部開始修復，表現為血管再生、新骨形成和死骨吸收;隨著修復向死骨中央推進，死骨吸收增強，而血管再生和新骨形成明顯減弱。研究證實，miRNA在基因調控血管生成過程中發揮重要作用。目前，關于miRNA在股骨頭壞死發生、發展過程中的作用少見報道。2011年11月～2013年6月，我們采用基因芯片檢測股骨頭壞死患者的壞死骨組織中miRNA表達譜，并對有顯著變化的miRNA進行RT-PCR定量分析。現報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇臨沂市人民醫院收治的正常粗隆間骨折患者4例(對照組)、股骨頭壞死需人工股骨頭或全髖人工關節置換患者4例(觀察組)，男7例、女1例，年齡55～76歲。排除糖尿病、免疫系統慢性疾病。術中留取負重區軟骨下骨組織2～5 g裝入凍存管，置液氮中，1 h內轉入超低溫冰箱凍存備用。

1.2miRNA檢測方法取兩組骨組織標本，加入Trizol試劑提取總RNA。將1 μg總RNA加入1.5mL EP管，加入500 μL 1mmol/L Tris-Cl緩沖液，再加入1 μL ATP充分混勻;離心后收集管底溶液，放置于冰上。取0.2mL EP管，加入1 μg總RNA。如樣品體積超過8 μL，使用真空濃縮儀濃縮至8 μL以下，置于冰上。再根據制備poly(A)加尾及生物素標記miRNA和miRNA基因芯片雜交，通過聚類分析從基因芯片結果中尋找與對照組相比上調比例≥2和下調比例≤0.5的miRNA。對明顯變化的miRNA進行RT-PCR驗證，以2－ΔΔCt計算其表達量。1.3統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。所得數據以珋x±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

兩組采用miRNA芯片檢測426個miRNA，上調比例≥2的有2條(hsa-miR-494-st和hsa-miR-29ast)，下調比例≤0.5有1條(hsa-miR-486-5p-st)。兩組差異miRNA相對表達量比較見表1。

表1　兩組差異miRNA相對表達量比較()

表1　兩組差異miRNA相對表達量比較()

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別　hsa-miR-494-st　hsa-miR-29a-st hsa-miR-486-5p-st觀察組　2.32±1.42　3.56±5.02*1.85±1.24對照組4.13±3.18　1.16±0.15　3.78±2.69

3　討論

miRNA是一類長18～25 nt的內源性非編碼小RNA，由一段具有發夾樣結構、長70～80 nt的單鏈RNA前體剪切后形成［1］。miRNA廣泛存在于真核

生物中，具有高度保守性、時序性和組織特異性，對細胞組織的功能及生命活動起重要調控作用。由于其高度的時空特異性及類似于RNA干擾的特殊機制，使其在腫瘤的發病機制中廣受關注。miRNA的表達受到血流量的調控［2］。研究顯示，特異性miRNA可能與股骨頭壞死有關。Wang等［3］對壞死股骨頭患者血清miRNA進行深度測序，發現股骨頭壞死患者血清中存在異常表達的miRNA。王義生等［4］用靶向特異性基因小干擾RNA(siRNA)預防酒精性股骨頭壞死，發現利用siRNA腺病毒載體能夠阻斷MSCs和PPAR-γ基因表達，阻止其成脂分化，保持其成骨分化，促進骨修復，能在一定程度上預防酒精性股骨頭壞死。目前己知的作用于成骨細胞生成和分化相關通路的miRNA有miRNA-208［5］、miRNA-141和miRNA-200a［6］，它們通過調控BMP-2通路發揮作用，具有很強的促成骨分化能力;此外，miRNA-210可通過抑制AcvR1b抑制TGF-β/activin信號通路，促進成骨細胞的分化［7］。Suzuki等［8］觀察了miRNA-210在股骨頭壞死患者血漿中的表達，認為miRNA-210在股骨頭壞死過程可能起調控作用。

本研究對正常股骨頭和壞死股骨頭骨組織進行miRNA芯片檢測，共檢測426個miRNA;經聚類分析發現，上調比例≥2的有2條(hsa-miR-494-st和hsa-miR-29a-st)，下調比例≤0.5有1條(hsa-miR-486-5p-st)。RT-PCR檢測顯示，hsa-miR-494-st、hsamiR-486-5p-st的相對表達量與對照組比較差異無統計學意義，hsa-miR-29a-st的相對表達量較對照組顯著升高。hsa-miR-29a-st是一種在非編碼區小的調節基因，主要功能表現在轉錄與翻譯的水平上［9］。hsa-miR-29a-st是miRNA-29家族中的一個亞型［10～13］，其主要包括miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c，對人類腫瘤的發病起重要的調控作用。人類血液供應豐富的骨肉瘤中miRNA-29a、miRNA-29b較正常骨組織有顯著變化，主要表現為下調基因;其與直腸癌的發病率也有明顯的相關性。新近研究證實，miRNA通過靶基因E2Fs來參與調節細胞反應性缺氧缺血的各種生理病理過程［14］。因此推測，在正常股骨頭骨組織向股骨頭壞死組織轉化的過程中，上調基因hsa-miR-494-st、hsa-miR-29a-st及下調基因hsa-miR-486-5p-st可能通過某些靶基因的調控作用來完成，尤其是hsa-miR-29a-st在正常與缺血壞死性骨組織中存在明顯差異，其可能是加速股骨頭壞死的重要調控基因。

綜上所述，正常股骨頭骨組織與股骨頭缺血壞死性骨組織之間存在miRNA基因的變化，存在明顯上調與下調基因，這些miRNA可能引起調控血管靶基因受體的改變，使股骨頭骨組織血流受到影響，進一步加速股骨頭壞死。在股骨頭骨組織發生壞死的整個過程中，miRNA可能發揮著至關重要的作用。

參考文獻:

［1］Nicoli S，Standley C，Walker P，et al.microRNA-mediated integration of haemodynamics and Vegf signalingduring angiogenesis ［J］.Nature，2010，4(22): 1196-1200.

［2］Liud，Krueger J，Lenoble F.The role of blood flow andmicroRNAs in blood vesseldevelopment［J］.Int Jdev Biol，2011，55(4-5): 419-429.

［3］Wang X，Qian W，Wu Z，et al.Preliminary screening ofdifferentially expressed circulatingmicroRNAs in patients with steroid-induced osteonecrosis ofthe femoral head［J］.Molmed Rep，2014，10(6): 3118-3124.

［4］王義生，劉鳴，張林峰，等.靶向特異性基因小干擾RNA預防乙醇性股骨頭壞死的研究［J］.中華實驗外科雜志，2011，4(28): 611-614.

［5］Itoh T，Takeda S，Akao Y.MicroRNA-208modulates BMP-2-stmulatedmouse preosteoblastdifferentiation bydirectly targeting V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog［J］.J Biol Chem，2010，285(36): 27745-27752.

［6］Itoh T，Nozawa Y，Akao Y.MicroRNA-141 and -200a are involved in bonemorphogenetic protein-2-inducedmouse pre-osteoblastdifferentiation by targetingdistal-less homebox 5［J］.J Biol Chem，2009，284(29): 19272-19279.

［7］Mizuno Y，Tokuzawa Y，Ninomiya Y，et al.miR-210 promotes osteoblasticdifferentiation through inhibition of AcvR1b［J］.FEBS Lett，2009，7(7): 2263-2268.

［8］Suzuki O，Bishop AT，Sunagawa T.VEGF promoted surgical angiogenesis in necrotic bone［J］.Micmsurgery，2004，24(1): 85-91.

［9］Ambros V，Lee RC.The functions of animalmicroRNAs［J］.Nature，2004，9(16): 350-355.

［10］Zhang W，Qian JX，Yi HL，et al.ThemicroRNA-29 plays a central role in osteosarcoma pathogenesis and progression［J］.Mol Biol Cell，2012，11(46): 557-562.

［11］IoriomV，Ferracinm，Liu CG，et al.MicroRNA gene expressionderegulation in human breast cancer［J］.Cancer Res，2005，8(15): 7065-7070.

［12］Pekarsky Y，Santanam U，Cimmino A，et al.Tcl1 expression in chronic lymphocytic leukemia is regulated bymiR-29 andmiR-181 ［J］.Cancer Res，2006，12(15): 11590-11593.

［13］Biyashevd，Qin G.E2F andmicroRNA regulation of angiogenesis ［J］.Am J Cardiovascdis，2011，1(2): 110-118.

［14］Stamatopoulos B，Meuleman N，Haibe-Kains B，et al.MicroRNA-29c andmicroRNA-223down-regulation has in vivo significance in chronic lymphocytic leukemia and improvesdisease risk stratification［J］.Blood，2009，5(21): 5237-5245.

收稿日期:( 2015-05-08)

通信作者:李林

基金項目:吉林省教育廳十一五科學技術研究項目(2010-280)。

文章編號:1002-266X(2015)34-0074-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R681.8

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.033