鞘內注射谷氨酸受體6反義寡核苷酸對骨癌痛小鼠痛行為的影響

劉成龍，張飛，張娟(高郵市人民醫院，江蘇高郵5600;南京市鼓樓醫院)

鞘內注射谷氨酸受體6反義寡核苷酸對骨癌痛小鼠痛行為的影響

劉成龍1，張飛1，張娟2
(1高郵市人民醫院，江蘇高郵225600;2南京市鼓樓醫院)

摘要:目的探討鞘內注射谷氨酸受體6(GluR6)反義寡核苷酸對骨癌痛小鼠痛行為的影響。方法將32只雄性小鼠隨機分為NS組、同義組、錯義組、反義組，各8只。對小鼠左側股骨遠端骨髓腔接種NCTC2472纖維肉瘤細胞，建立骨癌痛模型。造模后1～6d，四組分別鞘內給予生理鹽水5 μL及同義寡核苷酸、錯義寡核苷酸、反義寡核苷酸各5 μg，1次/d。于造模前及造模后第5、7、10、14天測量小鼠左側足底機械性縮足反射閾值(PWMT)和熱縮足反射潛伏期(PWTL)。結果造模第5、7天，反義組的PWMT、PWTL維持在基礎值水平;造模后第10天，反義組左側足底PWMT開始下降，第14天PWTL開始縮短，與術前比較差異有統計學意義(P均＜0.05)，但與同義組、錯義組、NS組相比較，反義組PWMT、PWTL明顯增加(P均＜0.05)。結論鞘內注射GluR6反義寡核苷酸能改善骨癌痛小鼠的痛行為。

關鍵詞:骨腫瘤;癌痛;谷氨酸受體6;反義寡核苷酸;鞘內給藥;小鼠

癌痛是癌癥患者最常見的癥狀，超過50%的癌癥患者并發疼痛［1，2］，晚期癌癥患者疼痛發生率為75%～95%［3］。谷氨酸受體6(GluR6)是谷氨酸受體家族成員之一，在傷害性信號傳遞和調節的部位大量表達。研究顯示，在甲醛炎性痛模型中，大鼠脊髓背角GluR6表達明顯升高［4］。2014年10月～12月，我們對骨癌痛小鼠鞘內注射GluR6反義寡核苷酸，觀察GluR6在骨癌痛中的作用。

1　材料與方法

1.1材料SPF級雄性C3H/HeN小鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，4～6周齡，體質量20～25 g。NCTC2472纖維肉瘤細胞株(美國模式細胞菌種收集中心)，置于37℃、5% CO2培養箱中，用含10%馬血清的NCTC135培養基培養，每周傳代1～2次。反義寡核苷酸由上海生物工程有限公司合成，GluR6反義寡核苷酸序列: 5'-CTTCATGATGTTTCCGTG-3'，GluR6同義寡核苷酸序列: 5'-CACGGAAACATCATGAAG-3'，GluR6錯義寡核苷酸序列: 5'-TCTAGCTTCTGAGTTCGT-3'。

1.2骨癌痛模型的建立及鞘內置管參照文獻［5］方法制作骨癌痛模型。麻醉小鼠，行左膝關節切開術，在股骨內外側髁之間穿刺鉆孔，將纖維肉瘤細胞接種入股骨遠端骨髓腔中，骨蠟封閉穿刺孔。按照Furuse等［6］的方法，于模型制作完成即刻行小鼠鞘內置管，以小鼠尾巴和后肢完全癱瘓為置管成功。

1.3動物分組與給藥方法造模成功后將小鼠隨機分為NS組、同義組、錯義組、反義組各8只。造模后1～6d，四組分別鞘內注射生理鹽水5 μL及同義寡核苷酸、錯義寡核苷酸、反義寡核苷酸各5 μg，藥物在10 s內注完并用4 μL生理鹽水沖洗導管。

1.4痛行為學測定［5］各組于造模前及造模后5、7、10、14d進行痛行為學測定。將小鼠放在底部為金屬網的有機玻璃箱中，用von Frey纖毛測試機械性縮足反射閾值(PWMT);將小鼠放在底層為3mm厚玻璃板的有機玻璃箱中，用熱輻射刺激儀測試熱縮足反射潛伏期(PWTL)。

1.5統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組內比較采用單因素方差分析Dunnett法，組間比較用單因素方差分析LSD法。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

四組造模前后PWMT、PWTL比較見表1。

3　討論

骨癌痛除腫瘤本身原因之外，炎性痛和神經病理性疼痛機制也參與其中［7］。骨癌早期腫瘤生長

刺激破骨細胞，促進骨質破壞，引起炎性細胞浸潤并釋放大量炎性因子;后期腫瘤生長，引起周圍神經的壓迫、缺血;癌細胞還可分泌蛋白溶解酶，對神經末梢產生損害作用。骨癌痛相關痛行為主要包括自發性疼痛和誘發性疼痛兩大類。本實驗通過機械痛敏和熱痛敏來檢測骨癌痛小鼠的誘發痛行為。根據我們前期的研究，造模后3d，小鼠因膝關節切開術的炎癥反應而表現為痛行為學的變化，造模后5d均恢復到術前水平，因此術后第5天開始可排除手術因素對小鼠痛行為的影響;造模7d開始出現機械性痛敏，10d開始出現熱痛敏，并隨時間延長而加重;造模14d后，痛行為學指標變化明顯且機械痛閾和熱痛閾數值穩定［8～10］;造模14d時，HE染色示股骨腫瘤細胞大量生長，X線檢查示患側肢體已有輕微骨質破壞［11］。因此選擇造模后5、7、10、14d觀察癌痛情況，可以獲得較為可靠的痛行為學數據。

表1　四組造模前后PWMT、PWTL比較()

表1　四組造模前后PWMT、PWTL比較()

注:與同組術前比較，#P＜0.05;與其他三組比較，*P＜0.05。

組別PWMT(g)術前　　術后5d　　術后7d　　術后10d　　術后14d PWTL(s)術前　　術后5d　　術后7d　　術后10d　　術后14d反義組　1.75±0.41　1.78±0.76　1.52±0.54 1.22±0.20#*1.08±0.25#*18.91±0.99 17.58±1.76 17.52±1.54 15.92±1.20 13.38±0.65#*錯義組　1.73±0.12　1.86±0.66　1.08±1.09#1.45±0.14#1.35±0.17#　17.58±1.02 18.26±0.66 17.38±1.09 13.45±1.72#9.35±0.47#同義組　1.60±0.12　1.75±0.36　1.19±0.69#1.54±0.12#1.56±0.14#　17.30±1.12 17.65±0.36 18.59±0.69 13.54±1.02#9.56±0.74#NS組　1.84±0.52　1.94±0.23　1.16±1.20#1.98±0.18#1.56±0.24#　18.34±1.52 18.99±1.23 17.96±1.20 12.98±1.58#8.56±1.34#

研究證明，GluR6參與了傷害性感受的傳遞過程，炎性痛能夠調節外周和中樞GluR6的表達［12，13］。Li等［14］研究發現，GluR6參與調節興奮性突觸后電流。另有研究顯示，預注射GluR6反寡義核苷酸不僅可以抑制炎性痛模型GluR6蛋白的表達，也能緩解其疼痛行為。反義寡核苷酸通過序列特異地與靶mRNA結合而抑制基因表達，是一類理想的、基因水平調控的治療藥物。本文設計了正義、錯義、反義3種寡核苷酸，分別將其注入小鼠腦脊液中;結果顯示，與生理鹽水組比較，反寡義核苷酸組疼痛明顯緩解，而錯義、同義組差異無統計學意義。由于反寡義核苷酸能抑制GluR6受體表達，而正義和錯義雖然核苷酸是一樣的，但序列順序不一樣，導致其不能抑制GluR6受體表達，因此小鼠的疼痛不能被緩解，進一步證明GluR6受體在骨癌痛的發生中起重要作用。本研究顯示，術后第5天因骨癌痛尚未形成，因此四組間的痛行為學相似;第7天出現機械痛敏，但反義組疼痛顯著輕于其他三組;第10天出現熱痛敏，同樣反義組顯著輕于其他三組。因此認為，使用GluR6反寡義核苷酸能夠有效緩解骨癌痛小鼠的痛行為。

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收稿日期:( 2015-01-07)

基金項目:江蘇省揚州市“科教興衛”項目(48)。

文章編號:1002-266X(2015)34-0028-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R738

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.011