UPLC-DAD法測定鳳岡鋅硒茶酒中的咖啡因

馬 瑩 周勝菊

（貴州省食品藥品檢驗所，550004） (貴州醫(yī)科大學(xué)神奇民族醫(yī)藥學(xué)院）

茶酒是以茶葉為主要原料，經(jīng)過發(fā)酵、直接浸提或者過濾勾兌而得的一種具有特殊口味和保健功能的飲料酒，屬于保健酒的一個類別。隨著國內(nèi)外茶酒研究逐漸深入，茶酒產(chǎn)品已有20多個品種被開發(fā)。以貴州省鳳岡縣特產(chǎn)有機鋅硒茶為原料釀造而成的鳳岡鋅硒茶酒就是眾多茶酒中獨具特色的一種。茶與酒經(jīng)過特殊的工藝操作配制，感官上不僅具有酒的醇柔還保留了茶的清香，風(fēng)味優(yōu)雅、口感柔和，且能使其中的營養(yǎng)成分集于一體，所以深受人們關(guān)注，并被越來越多的人接受和喜愛，逐漸成為保健酒的一個重要的類別。咖啡因是茶酒的重要品質(zhì)指標(biāo)，也是茶酒中的重要安全性指標(biāo)。目前，茶酒中咖啡因含量測定方法尚未見報道。本文首次建立了鳳岡鋅硒茶酒中咖啡因含量測定的超高效液相色譜法，可有效監(jiān)控鳳岡鋅硒茶酒中咖啡因的含量，也為今后針對茶酒進行的各類質(zhì)量研究提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

一、儀器與材料

1.儀器

UPLC-HClass超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XS105DU電子天平（德國METTLER TOLEDO公司）。

2.試劑

甲醇（分析純：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；色譜純：美國Tedia公司）；水（去離子水：實驗室自制）。

3.對照品與樣品

咖啡因?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院提供，含量100%，批號：171215-201010）；鳳岡鋅硒茶酒樣品（貴州鳳岡文土鋅硒開發(fā)有限公司提供；凈含量750mL，酒精度40%Vol，原料為泉水、大米、茶葉、蔗糖、酒曲）。

二、試驗方法

1.溶液的制備

（1）對照品溶液的制備。精密稱取咖啡因?qū)φ掌?.01017g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含咖啡因0.5085mg的對照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。取鳳岡鋅硒茶酒適量，混勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

（3）陰性溶液的制備。取原料含水、大米、蔗糖、酒曲而不含茶的白酒作為陰性樣品溶液，取適量，混勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為陰性溶液。

2.色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（美國Waters公司，1.7μm，2.1×100mm，柱號021933135156 06）；流動相：甲醇-水（35∶65）；檢測波長272nm，掃描范圍190～400nm；流速0.1mL/min；柱溫30℃。分別精密吸取制備好的3種溶液各1μL注入UPLC，在上述色譜條件下進行分析，記錄色譜峰，計算分離度、理論塔板數(shù)等參數(shù)，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

3.方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系實驗。精密稱取咖啡因?qū)φ掌?.01017g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取1、2、3、4、5、6mL，分置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。分別精密吸取上述溶液各0.5μL，注入UPLC，記錄色譜圖，以峰面積A為縱坐標(biāo)，咖啡因的量c（μg）為橫坐標(biāo)，繪制線性回歸曲線，計算線性方程及相關(guān)系數(shù)。

（2）儀器精密度試驗。精密吸取咖啡因?qū)φ掌啡芤?.5μL，連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定峰面積，計算6次峰面積值的RSD。

（3）重復(fù)性試驗。按照“對照品溶液的制備”方法，制備6份供試品溶液，分別進樣0.5μL，測定峰面積，計算樣品中咖啡因的含量，并計算含量平均值及RSD。

（4）穩(wěn)定性試驗。取重復(fù)性試驗中的第1份供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、24h進樣共6次，測定咖啡因峰面積，計算6次峰面積值的RSD。

（5）回收率試驗。采用加樣回收法進行試驗。精密稱取咖啡因?qū)φ掌?.02023g，置50mL容量瓶中，加甲醇適量溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為回收率對照品溶液。取鳳岡鋅硒茶酒適量，混勻，精密吸取9份溶液各5mL，分別置10mL容量瓶中，其中，第1、2、3份分別精密加入咖啡因回收率對照品溶液2mL、第4、5、6份分別精密加入咖啡因回收率對照品溶液2.5mL、第7、8、9份分別精密加入咖啡因回收率對照品溶液3mL，9份試樣分別用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22μm微孔膜濾過，取續(xù)濾液注入UPLC進行含量測定，計算咖啡因回收率。

4.樣品含量測定

取鳳岡鋅硒茶酒樣品6批，按上述方法制備對照品溶液和供試品溶液，分別進樣0.5μL，記錄色譜圖，測定峰面積，計算樣品中咖啡因的含量。

三、結(jié)果

1.系統(tǒng)適應(yīng)性

在前述色譜條件下，咖啡因與雜質(zhì)峰分離完全，分離度大于1.5，對照品及供試品色譜中咖啡因峰的理論塔板數(shù)均不小于5000（圖1～3）。

圖1 咖啡因?qū)φ掌飞V圖

圖2 供試品溶液色譜圖

2.線性關(guān)系結(jié)果

計算線性回歸方程得：A=31550227c-281943，r=0.99997，結(jié)果表明在0.05085～0.3051μg范圍內(nèi)，咖啡因的量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.儀器精密度結(jié)果

結(jié)果6次峰面積值的RSD=0.64%，表明儀器精密度良好。

4.重復(fù)性結(jié)果

結(jié)果樣品含量6次測定值在0.2116～0.2123 mg/mL范圍內(nèi)，平均含量為0.2120mg/mL，RSD=0.13%，表明樣品重復(fù)性良好。

5.穩(wěn)定性結(jié)果

結(jié)果6次峰面積值的RSD=0.15%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

6.回收率結(jié)果

該實驗的回收率在99.02%～100.33%之間，RSD=0.45%，結(jié)果表明用此方法測定咖啡因含量的準(zhǔn)確度良好。詳見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果

7.樣品含量測定結(jié)果

按前述方法對6批鳳岡鋅硒茶酒樣品中的咖啡因進行含量測定，結(jié)果各批次鳳岡鋅硒茶酒中咖啡因的含量在0.20～0.26mg/mL范圍內(nèi)，詳見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果 mg/mL

四、討 論

1.將咖啡因?qū)φ諛?biāo)準(zhǔn)溶液進行紫外-可見全波段掃描（190～800nm），結(jié)果得到咖啡因的2個吸收峰分別處于204.8nm和272.2nm處。為避免溶劑的末端吸收及雜質(zhì)峰的影響，故選擇272nm作為檢測波長。大于400nm波長范圍咖啡因紫外-可見吸收值為0，故方法中波長掃描范圍確定為190～400nm。

2.對流動相比例、流速、柱溫進行考察，實驗表明在流動相比例為甲醇∶水(體積比)=35∶65、流速為0.1mL/min、柱溫為30℃時，出峰保留時間適中，峰型對稱，咖啡因峰與雜質(zhì)峰分離完全，故本方法選定了前述的色譜條件。

3.本研究采用了超高效液相色譜儀（UPLC）建立咖啡因含量測定方法并完成方法學(xué)考察。用高效液相色譜儀（HPLC）及HPLC色譜柱對該方法進行了適用性考察。結(jié)果所得HPLC圖譜中，咖啡因保留時間較長，峰型較差，理論塔板數(shù)較低，分離度不理想，今后將繼續(xù)對該方法進行改進，使之同樣適用于HPLC，以便能被更廣泛地應(yīng)用。

4.該方法亦可用于其他各類水基液體樣品中咖啡因的檢測。當(dāng)咖啡因作為禁用物質(zhì)被檢測時，如樣品色譜中在與咖啡因?qū)φ掌飞V相應(yīng)位置處出現(xiàn)色譜峰，應(yīng)比對該物質(zhì)的光譜與咖啡因光譜的一致性，進行定性鑒別。

5.經(jīng)實驗得該方法對咖啡因的最低檢出濃度為0.4μg/mL。用該方法對菩提子酒、幸九酒、金花茶酒3種原料中含茶的保健酒進行咖啡因的檢測，結(jié)果均未檢出咖啡因。說明原料含茶的酒中并不一定含有咖啡因。含咖啡因與不含咖啡因茶酒品質(zhì)及功效的差別需進行更深入研究后方能確定。