抗真菌肽Drosomycin在原核生物表達系統中的可溶性表達

吳文梅 李彩婷 楊婉瑩*

（華南農業大學動物科學學院，廣州 510642）

真菌是生物界中很大的一個類群，現已發現對人類有致病性的真菌約有300多個種類[1]。市面上所用抗真菌類藥物，副作用大，易產生抗藥性[2]。而抗真菌肽卻有望解決這些弊端。

抗真菌肽Drosomycin來自于果蠅，屬于天然蛋白質，相對分子質量小，熱穩定性好，遇水易溶解，可作為抗生素的替代品，為我們解決抗生素耐藥性提供新材料[3][4]。楊婉瑩等從2002年開始對抗真菌肽及其家族蛋白的研究，結果表明Drosomycin對絲狀病原真菌具有廣譜的抑制活性，可以作為新的抗真菌藥物的靶標[5][6][7]。但Drosomycin在果蠅體內含量極微，天然資源有限，提取步驟煩瑣、成本高，得率低，不利于工業生產[8]。因此利用分子生物學技術進行體外表達成為研究熱點。

Drosomycin成熟肽包括44個氨基酸，其中8個半胱氨酸形成4對二硫鍵，由于結構的復雜性，在利用原核系統表達該蛋白時往往形成包涵體，后續純化復性步驟復雜，不利于實際利用。本實驗利用大腸桿菌原核生物表達系統，通過對冷休克表達載體pcold TF進行改造，實現Drosomycin體外的可溶性表達，為下一步生產應用奠定基礎，同時為探索富含二硫鍵的蛋白在體外的分離純化提供一條線索。

1 材料與方法

1.1 材料，質粒

果蠅細胞sf9由本實驗室保存,大腸桿菌E.coli（DH5α）感受態細胞，BL21（DE3）感受態細胞均購自北京天根生物公司；質粒pCold TF由崔玉寶教授贈送。

1.2 酶類及其他試劑

胰蛋白胨（Tryptone）、酵母抽提物（Yeast Extract）、氯化鈉（NaCl）為上海生物生工有限公司產品；氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）、異丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）、X-gal、預染蛋白Marker購自廣州翔博生物技術有限公司；蛋白質 Maker、RNA酶A，Western blot膜封閉液購自北京天根生物公司；Trizol Reagents總RNA抽提試劑盒，各規格DNA Marker、限制性內切酶(NdeⅠ、XhoⅠ)、PCR聚合酶、反轉錄用試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）、T4 DNA ligase、pMD19-T 載體、Primer-STAR DNA 聚合酶、dNTP Mixture（各 10 mmol/L）均購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；鼠抗Penta-His抗體購置碧云天生物技術有限公司；HRP-兔抗鼠結合物購自北京全式金生物技術有限公司；Ni-NTA親和層析填料鎳購自伯樂生物科技有限公司。其他化學試劑均是國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 果蠅細胞sf9的DNA提取

取實驗室培養的果蠅細胞sf9,待平板長到80%-90%時，加入Trizol裂解細胞，隨后將平板中的細胞轉入1.5 ml的EP管中，按照常規方法氯仿/異丙醇步驟變性蛋白質，抽提其RNA[9],最后利用試劑盒將其反轉錄成DNA，于-20℃保存。

1.3.2 抗真菌肽Drosomycin基因的PCR擴增

根據 NCBI上已登錄 (NM079177)的Drosomycin(Drs)基因序列設計了一對引物，上游引物 Drs-F:5’-CGCCATATGGACTGCCTGTCCGG-3’（橫線所示為NdeⅠ酶切位點），下游引物 Drs-R:5’-CCGCTCGAGTTAGCATCCTTCGCA-3’（橫線所示為 XhoⅠ酶切位點），引物由上海生物生工有限公司合成。

以抽提果蠅的DNA為模板，用上述引物擴增Drs編碼基因，PCR反應體系包括TaKaRa Taq （5 U/μl） 0.25 μl；10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）5 μl；dNTP Mixture（各2.5 mM） 4 μl；上游引物（20 μM）1 μl；下游引物（20 μM） 1 μl；cDNA First-strand 1μl，添加滅菌ddH2O至總體積為50 μl。PCR反應：預變性98℃ 5 min，變性98℃30 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，32個循環，延伸72℃ 10 min。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，用天根膠回收試劑盒切膠回收目的基因。

1.3.3 重組載體pCold TF-Drs的構建

質粒pCold TF和體外擴增的目的基因Drs用限制性內切酶Nde I和XhoI進行雙酶切，50 μl酶切體系為：質粒DNA/Drs 30 μl，10xH bueffr 5 μl，XhoI 2.5 μl，NdeI 2.5 μl，加 ddH2O 10 μl補足 50 μl酶切體系，37℃酶切8 h。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物，在紫外燈下用無菌手術刀片切下線狀載體DNA和PCR產物的條帶，按膠回收試劑盒說明書操作，回收目的載體片段和PCR產物。將Drs的酶切純化產物和表達載體pCold TF的酶切純化產物于16℃連接8 h，反應體系10 μl：PCR純化產物5 μl，pCold TF 酶切產物 3 μl，T4 ligase 1 μl，T4 ligase buffer 1 μl. 然后轉化進大腸桿菌DH 5α感受態細胞。將通過菌液PCR鑒定成功的重組質粒送上海生工測序。

1.3.4 重組載體pCold TF-Drs的誘導表達及SDS-PAGE鑒定

將測序正確的pCold TF-Drs轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中,利用含有Amp(氨芐青霉素)抗性的平板篩選陽性重組子。將篩選成功的含有pCold TF-Drs重組菌BL21(DE3)單菌落,接種到LB培養基中,37℃培養箱過夜振蕩培養，然后取菌液按1:100體積比轉接LB培養基，37℃振蕩培養3 h至 OD600nm=0.4-0.5左右，添加IPTG 0.5 mM進行誘導表達，15℃培養24 h。收集細菌，用適量PBS重懸后進行超聲破碎，超聲6 s,間隔10 s,超聲90次，菌體破碎液用低溫離心機進行收集，10 000 r/min，4℃，離心30 min，分別取全蛋白、超聲破碎上清、超聲破碎沉淀各16 μl,加入4 μl 5X SDS loading buffer,100℃加熱10 min變性蛋白，用12%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳，結束后用考馬斯亮藍G250染色。

1.3.5 Western blot鑒定

按上述方法進行SDS-PAGE,然后將蛋白轉至PVDF膜,電泳儀參數設置為電壓100 V，70 min,將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉中，至搖床上室溫封閉30 min；倒出封閉液，加入4 ml脫脂奶粉稀釋的一抗（抗His標簽鼠單抗），稀釋比例為1:1 000，盡可能排除氣泡，于搖床4℃雜交過夜。使用后回收一抗；去除一抗后將膜用20 ml TBST清洗3次，每次置于搖床清洗10 min；將膜置于新的平皿中，加入4 ml脫脂奶粉稀釋的二抗（HRP標記山羊抗小鼠IgG），稀釋比例為1:1 000，至搖床上室溫孵育2 h以上；去除一抗后將膜用20 ml TBST清洗3次，每次置于搖床清洗10 min；將洗好的PVDF膜置暗房中，滴加發光液進行化學發光顯色，X光膠片曝光顯影定影后保存膠片。

1.3.6 融合蛋白的分離純化

重組融合蛋白的純化是通過Ni-NTA親和層析柱完成，具體過程主要包括以下步驟：先取一定量的Ni-NTA填料，加到柱子里，用10個柱體積的PBS對柱子進行洗滌與平衡；蓋緊下面的帽子，取超聲破碎的上清加入到柱子中，蓋緊上面的帽子，4℃，旋轉混勻30 min；固定柱子，摘掉兩個帽子，讓溶液全部自然流下，收集樣品，用于檢驗；用含有25 mM咪唑的PBS清洗柱子，直到OD280沒有變化時，停止洗滌；分別用含有25 mM，50 mM，100 mM，150 mM，300 mM 咪唑 Tris洗脫柱子上的目的蛋白，收集蛋白，通過SDS-PAGE進行染色檢測是否干凈；用含有1 M咪唑的Tris，清洗柱子，使柱子上的蛋白完全洗下來；用0.5 M NaOH清洗柱子；用20%酒精保存柱子。分別檢驗不同濃度的咪唑洗脫液中的蛋白，取收集的各管蛋白制樣，進行SDS-PAGE檢測，檢測洗脫目的蛋白的最適咪唑濃度。

2 結果與分析

2.1 重組載體pCold TF-Drs的構建

以果蠅的DNA為模板，PCR擴增目的基因Drosomycin，電泳檢測目的條帶符合預期大小（圖1）。切膠回收目的條帶，酶切后連接到pCold TF載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞（圖2），將構建成功的重組載體pCold TF-Drs送上海生物生工公司測序，結果與預期的一致。

2.2 質粒pCold TF-Drs原核表達及鑒定

取測序成功的重組質粒pCold TF-Drs轉化BL21（DE3）感受態細胞中，挑取單菌落培養至OD600為0.4用IPTG進行誘導，15℃培養24 h，離心收集菌體超聲破碎，收集樣品進行SDS-PAGE電泳，并進行Western-blotting檢測，結果如圖3、圖4所示。從圖中可以看出融合蛋白TF-Drs表達的蛋白質相對分子質量大小為60 ku(所含Drs為5 ku)，與預期結果一致。Western blot結果也顯示攜帶His標簽的融合蛋白可以與鼠抗Penta-His抗體識別。

2.3 融合蛋白pCold TF-Drs的分離純化

將15℃表達的細菌裂解液上清，通過Ni-NTA柱親和層析純化，洗脫咪唑濃度梯度依次為20 mM、40 mM、60 mM、300 mM。分別取每個濃度梯度的洗脫液，進行12%SDS-PAGE檢測，檢測結果如圖5所示，可見：細菌裂解液上清中呈可溶性表達，融合蛋白pCold TF-Drs在Ni-NTA柱洗脫咪唑濃度為300 mM時，洗脫純化效果最好。經Ni-NTA柱親和層析純化，獲得300 mM咪唑的洗脫液，進一步使用分子篩SephadexP-10層析柱去除咪唑和脫鹽。脫鹽后的融合蛋白再使用10 KDa的超濾管進行超濾濃縮，獲得的融合蛋白pCold TF-Drs經SDS-PAGE檢測，表明融合蛋白得到很好的純化(圖6)。

圖1 目的基因Drs擴增電泳圖

圖2 pCold TF與Drs雙酶切回收電泳圖

圖3 融合蛋白TF-Drs的SDS-PAGE檢測

圖4 融合蛋白TF-Drswestern blot檢測

圖5 融合蛋白TF-Drs的Ni-NTA純化

圖6 融合蛋白TF-Drs的脫鹽純化

3 討論與結論

大腸桿菌原核生物表達系統由于其生長周期短，生長速度快，轉化外源DNA操作簡單，可以大規模發酵培養，被認為是一種體外合成重組蛋白最簡單的外源表達系統，但是多數情況下外源表達產物形成非活性的包涵體蛋白，不利于后續實驗[10]。本實驗室前期構建過pET 3C-Drs表達質粒，轉化進大腸桿菌BL21（DE3）后，目的蛋白主要以包涵體的形式表達，需要變性，復性，不利于生產操作[11]。pCold TF-Drs作為表達載體與pET系列載體對比而言，它具有TF標簽可以促進目的蛋白的可溶性表達，純化簡單，標簽容易移除。同時，它還是是一個低溫冷休克表達載體，表達目的蛋白穩定[12]。

通過本次實驗，確定了將目的基因抗真菌肽Drosomycin定向克隆到原核生物表達載體pCold TF后，將構建正確的重組載體pCold TF-Drs轉化大腸桿菌 BL21(DE3)，IPTG誘導外源蛋白表達，SDS-PAGE電泳檢測發現獲得的目的蛋白相對分子質量單位為60 kDa，與預期值（55 kDa+5 kDa=60 kDa）相一致。Western Blot結果也表明，該蛋白可被鼠抗His抗體識別，表明在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達的蛋白是目的蛋白。通過超聲破碎 pCold TF-Drs轉化菌（BL21），用SDS-PAGE顯示其大部分在上清中，表明是可溶性表達。

本實驗成功構建了重組質粒pCold TF-Drs,實現了目的蛋白在原核生物表達系統中的可溶性表達，為下一步酶切純化出抗真菌肽Drosomycin實現生產上的利用，對植物類病原真菌的抑菌活性檢測，藥理藥效的研究以及開發抗真菌藥物奠定了基礎。

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