急性冠脈綜合征患者外周血單核細胞miR—145與超敏C反應蛋白的相關性研究

姜春玲

[摘要]目的探討急性冠脈綜合征（ACS）患者外周血單核細胞（PBMCs）miR-145與超敏C反應蛋白的相關性。方法選取急性冠脈綜合征患者90例，其中不穩定型心絞痛（UAP）30例（A組），ST段抬高型心肌梗死（STEMl）30例（B組）和非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMl）30例（C組）。另外30例以心前區不適住院，既往無高血壓、糖尿病和冠心病史，經心電圖、心肌酶學和冠狀動脈造影排除冠心病者作為對照組（D組）。采用Rcal-time PCR法檢測PBMCs中miR-145表達水平，使用U6作為內參對照。采用ELISA法檢測超敏C反應蛋白（hs-CRP）水平。結果A組、B組、C組分別與D組比較，ACS患者外周血單核細胞miR-145表達水平明顯降低，均有統計學意義（P<0.05）；A組、B組、C組分別與D組比較，PBMCs培養基上清中細胞因子hs-CRP水平明顯升高，均有統計學意義（P< 0.05）；Pcarson相關分析結果顯示，ACS患者外周血單核細胞miR-145表達與hs-CRP水平呈負相關性（r=-0.84，P<0.05）。結論ACS患者外周血單核細胞miR-145與超敏C反應蛋白之間呈負相關性，可能成為ACS新型標志物。

[關鍵詞]急性冠脈綜合征；外周血單核細胞miR-145；超敏C反應蛋白

中圖分類號：l541.4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-816X（2015）05-0359-03

急性冠脈綜合征（Axute coronary svndrom，ACS）作為常見的心臟急癥，是心血管疾病中致死致殘的主要原因，包括不穩定心絞痛（Unstable Angina Pectoris，UAP）和急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI），而AMI包括非ST段抬高型心肌梗死（Non-ST-Elevation MvocaHlial Infarction，NSTEMI）、ST段抬高型心肌梗死（ST-Elevation Myocardial Infarction，SIEMI）。文獻報道，m1R-145在正常動脈血管和已分化的血管平滑肌（VSMCs）中表達最豐富，但在球囊損傷血管、ACS及去分化的VSMCs中表達很低。miR-145是VSMCs的表型調節器，通過對VSMCs的調節而成為ACS的保護因子，但在ACS中的表達情況目前尚不明確。本文對ACS患者血漿miR-145變化及其與hs-CRP的相關性進行探討。

1.資料與方法

1.1.臨床資料：選取2011年3月至2014年3月本院住院確診為ACS患者90例，UAP、AMI診斷均按美國心臟病學會/美國心臟協會（2009年）標準，且均經冠狀動脈造影證實。其中30例UAP（A組），60例AMI分為30例SIEMI（B組）和30例NSTEMI（C組）。另外30例以心前區不適住院，既往無高血壓、糖尿病和冠心病史，經心電圖、心肌酶學和冠狀動脈造影排除冠心病者作為對照組（D組）。本研究經倫理委員會批準，所有患者均自愿加入并簽署知情同意書。

1.2.方法：患者均在發病6h內從靜脈采取空腹血3ml，肝素鈉抗凝。PBMCs采用人外周血淋巴細胞分離液密度梯度離心法進行分離：①置于EDTA—N0抗凝管，將新鮮血液轉移至15ml離心管中，加入無菌的5mlPBS等倍稀釋血液，上下顛倒混勾。②避光吸取5ml淋巴細胞分離液置于另一l5ml離心管，用吸管吸取稀釋的血液，沿管壁小心緩慢加于淋巴細胞分離液上方，形成清晰界面。放入平衡離心機，室溫下，2000轉/min，離心30min。③離心后可以觀察到管內液體分為三層，上層為淡黃色的血漿和PBS，下層主要是紅細胞層，層為分離液層，上中層界面一層白色絮狀物質即為單個核細胞層或白膜層。④用吸管小心吸取白膜層，置于另一l5ml離心管中，加入2～3倍體積的無菌PBS，上下顛倒混勻，2000轉/min，離心10min。⑤倒掉上清，同法沉淀洗滌兩次。⑥將⑤所得單個核細胞用900μL Trizol重懸，吸取置于無酶無菌1.5ml EP管中，暫時凍存于-80℃冰箱中以備提取RNA。

采用Real—time PCR法（ABI9700型PCR擴增儀由美國ABI公司：熒光定量PCR儀由德國Eppendorf公司：hsa-miR-145 real—time及RT—PCR引物由廣州銳博生物科技有限公司：U6 real—time及RT—PCR引物由廣州銳博生物科技有限公司提供）檢測PBMCs中miR-145表達水平，使用U6作為內參對照。分離的PBMCs用含10%小牛血清的RPMI1640調整細胞濃度2×10⁶/ml，加入植物血凝素（PHA）5ng/ml濃度，置于37℃，5%C0₂培養箱培養48h后，收集上清液儲存于-20℃用于hs-CRP檢測。采用ELISA法（美國Beckman公司的IM-MAG全自動特種蛋白分析系統）檢測hs-CRP水平，試劑盒由Beckman公司提供，嚴格按照試劑盒的說明操作。

2.結果

2.1.一般臨床資料比較：A組、B組、C組分別與D組比較，在年齡、性別、體質指數（BMI）、舒張壓（SBP）、收縮壓（DBP）、空腹血糖（FPG）等構成上無統計學意義（P>0.05）；A組、B組、C組分別與D組比較，ACS患者總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）明顯升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）明顯降低，均有統計學意義（P<0.05）。

2.2.四組m1R-145相對表達水平：A組、B組、C組分別與D組比較，ACS患者外周血單核細胞miR-145相對表達水平明顯降低，均有統計學意義（P<0.05）。且A組、B組、C組之間無統計學差異（P>0.05）。采用ELISA法檢測hs-CRP水平，PBMCs培養基上清中細胞因子檢測結果表明，A組、B組、C組分別與D組比較，PBMCs培喬基上清中細胞因子hs-CRP水平明顯升高，均有統計學意義（P<0.05），且A組、B組、C組之間無統計學差異（P>0.05），見表1。

2.3.ACS患者外周血單核細胞miR-145與hs-CRP的相關性：Pearsom相關分析結果顯示，ACS患者外周血單核細胞miR-145相對表達水平與hs-CRP水平呈負相關性（r=-0.84，P<0.05）。

3.討論

ACS在我國發病率日益上升，是臨床上常見的急危重癥。ACS發生早期患者主要表現為胸痛癥狀，如果能在心肌尚未壞死的可逆階段及時診斷并采取相應的治療措施，可以大大降低死亡率和致殘率。目前，肌鈣蛋白（cTnT或cTnl）和肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）是診斷ACS特異性和敏感性較高的標志物，但在癥狀出現6h內靈敏度不高，而且難以檢測微小型AMI，早期診斷能力受到限制，篩選新的心肌損傷標志物用于ACS診斷具有重要臨床意義。

miRNA是一種單鏈非編碼RNA，包含19-25個核苷酸，通過與靶基因mRNA的3，非編碼區特異性結合，促進靶基因降解或抑制轉錄，進而調控靶基因的表達，在機體細胞的分化、增殖、凋亡等生理病理過程發揮重要作用。miRNA廣泛存在于動植物體內，在人類血液、唾液、尿液等體液中均有分布，目前主要作為惡性腫瘤、肌肉損傷、炎癥反應等情況的生物標志物。miR-145由23個核苷酸組成，定位于人類染色體Sq32上，在VSMCs高度表達，參與VSMCs收縮表型的維持與正常增殖而成為動脈粥樣硬化的保護因子，但其在心血管事件中的變化情況目前尚未權威數據。

本研究中ACS患者miR145表達水平低于正常對照組，與Fichtlscherer的研究結果一致，Fichtlscherer認為miR-145主要作用是調節細胞骨架組件和PBMCs的遷移活性，參與血管內膜修復，因此ACS后miR-145的水平下降可能是斑塊破裂和血管損傷的結果。而宋翠珠則發現急性期腦梗死患者血漿miR-145的表達水平升高，推測可能是腦梗死患者使用的阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板藥物逆轉了不穩定斑塊炎癥反應時相，miR-145上升或是動脈粥樣硬化斑塊破裂急性期炎癥控制的間接表現。巨噬細胞浸潤可引起斑塊破裂部位出現明顯的炎性反應，升高的hs-CRP正是反映了這些巨噬細胞的活性，本研究采血前未給予相應的臨床治療，miR-145降低和hs-CRP升高均表明機體處于不穩定斑塊導致的炎癥高峰期，但miR-145具體釋放和影響機制目前尚不明確，而miR-145可能作為ACS生物標志物的假設，仍需要大量的基礎和臨床研究。

綜上所述，ACS患者血漿miR-145表達明顯下降，與炎癥反應水平呈負相關，可能作為ACS的一個新型生物標志物。