Toll樣受體參與心肌缺血再灌注損傷的研究進展

朱瑞卿++王悅喜

[關鍵詞] 心肌缺血再灌注損傷；Toll樣受體；缺血后適應

中圖分類號：R54 文獻標識碼：A 文章編號：1009-816X（2015）03-0224-03

再灌注治療在急性心肌梗死患者中應用逐漸增多，其引發的再灌注損傷日益受到人們的重視，對其發生機制進行了積極的探索研究，近年來研究發現，固有免疫的成員之一Toll樣受體在心肌缺血再灌注損傷的炎癥反應中起了重要作用，本文就Toll受體在心肌缺血再灌注損傷中的作用及發生機制展開綜述。

1 TLRs概述

Toll樣受體家族（TIRs）是最早被人類認識的免疫細胞的模式識別受體（PRRS），TIRs最初發現是果蠅背腹側蛋白質，隨后發現其是參與免疫反應的重要成員。TIR與病原體相關模式分子（PAMP）或損傷相關模式分子（DAMP）結合后，通過轉錄因子（NF-kB）和絲氨酸/蘇氨酸（MAP）激酶相關信號途徑，引起多種促炎癥因子的激活，通過炎癥反應清楚病原體感染。然而，過量出現的炎癥介質可能導致局部和全身性疾病，包括IPS引起的內毒素休克。為此免疫系統必須啟動相應的機制，對TIR介導的炎癥應答實施調節。到目前為止，已發現10種TIRs表達于人類，13種TIRs表達于小鼠，其中TIR1、TLR2、TIR4～6、TIR10～ 13在細胞表面表達，而TLR3、TIR7～9在細胞器上表達。前者主要識別病原表面某些共有特定的分子結構，如G+菌的肽聚糖、磷酸和G-菌的鞭毛蛋白等；后者主要識別胞質中病毒雙/單鏈RNA和胞質中細菌或病毒非甲基化CpG DNA，進而通過觸發MyD88依賴或非依賴的信號轉導途徑，誘導產生促炎細胞因子和I型干擾素。TLRs不僅表達于單核細胞、中性粒細胞等各種免疫細胞，還在心肌細胞、內皮細胞、外膜纖維原細胞等實質細胞中均有表達。目前對其在心臟分布和功能的研究尚不完全明確，近期在成人心臟組織中研究發現10種TLRs的mRNA，其表達相對水平是TIR4> TIR2>TLR3>TLR5>TLRl>TIR6>TIR7> TIR8> TLR9> TIRlO，Tian等采用免疫組織化學和免疫印跡發現心肌細胞表達TLR2和TIR4蛋白。采用基因敲除手段敲除TLR2或TLR4后對TIR2或TLR4進行功能學研究，發現TIR2及TIR4都在一定程度上參與了心血管疾病的免疫應答。但是至少可以確認的一點是心肌細胞表達TLR2和TIR4基因及蛋白，并能識別PAMPs和DAMPs啟動免疫應答。

2 TLR與心肌缺血再灌注損傷

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia/reper-fusion injury，MIRI）的概念首先由Tennings提出，表現為恢復缺血心肌的血供后組織損傷加重，甚至發生不可逆損傷的現象，其損傷包括心肌頓抑、無復流現象、再灌注心律失常、致命再灌注損傷等。心肌缺血再灌注損傷的發生機制，尚未完全闡明。一些研究表明固有免疫在MIRI的發病機制中起重要作用，而TLRs是固有免疫的基本成員，介導一系列重要的免疫應答，所以猜想Toll樣受體可能通過影響自由基、細胞內鈣超載和白細胞的激活來參與影響心肌缺血再灌注損傷的發生。MIRI會增加炎癥介質的表達如腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）和一氧化氮（N0）等，而強烈表達的炎癥因子對心臟產生明顯的負性作用，主要表現在心室功能紊亂，近些年的研究表明，再灌注損傷的心肌可通過TRL-2、TLRR-4介導的信號來影響心室功能紊亂的嚴重程度。心肌細胞的體外研究提示，過氧化氫誘導的氧化應激可明顯增加TLR-2參與介導的信號，此信號途徑亦可被TLR-2抗體阻滯，sakata等人已證明TLR2-TIRAP信號途徑促進MIRI的進展，并誘導成人左心室功能紊亂。

一些體外實驗表明，TLR2缺陷的心肌可以明顯衰減左心室舒張壓（LVDP）的恢復，盡管是體外實驗，但至少可以提示，心室功能紊亂與TIR2有一定關聯。TIR2缺陷的骨髓移植在野生型小鼠，其心肌梗死面積與TIR2缺陷小鼠的大致相同，但用正常小鼠骨髓移植在TLR2缺陷小鼠并不能減輕再灌注損傷，此外用TIR2抗體治療的小鼠可減輕心肌炎癥、細胞凋亡，TLR2陽性的白細胞也許可以決定MIRI的嚴重程度。TIR信號通路參與MIRI的機制除了炎癥反應外，與心肌細胞凋亡也有關。已有研究證明TIR2和TIR4與凋亡和生存通路有關。在TIRs家族中，基于目前的研究認為TLR-2、TIR-4與MIRI的發生最為密切。在MIRI時TIR2和TLR4通過識別不同的損傷性配體激活信號通路，激活后可引起不同的損傷表現，但TIR2和TIR4通路可能存在著交叉和共同徑路，從而具有協同和擴大損傷效應的作用。循環中的白細胞TIR和心肌細胞TIR參與MIRI的途徑與方式有所差異，但在功能上可能起到相互完善和互補的作用，在MIRI時，損傷性配體一部分可直接被心肌TIR識別并激活，另一部分進入循環激活白細胞TIR，從而產生一些列的趨化因子，促進炎癥因子和白細胞的聚集，促進炎癥反應，同時也可能活化了心肌TIR，使MIRI加重。白細胞TLR起到免疫監視的作用，并傳遞信號給心肌TIR，心肌TIR活化后作為主力軍產生一些列的損傷作用，它們共同形成完整的損傷體系。

TIR介導的信號通路有兩個，包括MyD88和TRIF依賴途徑，它們可能都參與調節MIRI。Kac-zorowski發現敲除小鼠心臟中的MyD88和TRIF，再灌注損傷后其血清中TNF-a、IL-6、IL-1、細胞間黏附分子（ICAM-1）和單細胞趨化因子（MCP-1）明顯減少，NF-KB是TIR-4調節信號通路的下游轉錄因子，被激活后進入細胞核，正性調節促炎細胞基因的表達。Yang和jiang在使用血管緊張素2受體阻滯劑（纈沙坦）預處理大鼠時，發現可減少TIR4和NF-KB的表達并改善MIRI。MIRI的發生不僅通過TIR4信號通路，也可通過與TIR信號通路相關的其它途徑，如P13/AKt信號通路、AMPK和EPK通路。zhao在實驗中發現，C3H/Hej（TIR4缺陷）鼠較野生型，其ERK和AMPK的信號表達更強，其離體心肌細胞抵抗收縮功能紊亂的能力更強，這可能與AMPK、ERK信號通路在C3H/Hej心臟的低氧活化能力更強有關，考慮TLR4信號可能抑制AMPK和ERK通路來實現MIRI。另一條TLR4/P13K/AKt依賴通路也可能參與MIRI的發生，在TIR4（-）小鼠中使用P13K抑制劑，其再灌注損傷不能得到改善，認為P13k/AKt可能通過增加磷酸化作用、心肌磷酸酶的失活、心肌糖原合成酶-3的失活來介導MIRI。MIRI中免疫細胞和非免疫細胞會釋放一些內源性配體，與TIR結合而激活各種固有免疫應答，應答過程受MyD88、TRIF途徑和其它相關通路的影響，最后通過激活NF-kB促進炎癥反應。endprint

3 TLRs 與心肌缺血預適應、后適應

現已有大量的實驗研究證明心肌缺血預適應（IPC）、后適應（IPOC）可通過降低心肌梗死面積，減少細胞凋亡，改善內皮功能及減輕心肌缺血組織水腫，對心肌缺血再灌注損傷發揮保護作用。而近些年來研究者猜想心肌缺血預適應、后適應IPC可能通過TLR2一TIRAP依賴途徑實現細胞保護作用，實驗中發現，預處理的野生型小鼠適應可能通過TIR起到減輕MIRI的作用。Izuishi等實驗證明，用HMGB1預處理的野生型小鼠，其肝的再灌注損傷與TIR4突變的小鼠相比明顯減輕，且肝細胞得到一定保護。此外在大腦缺血再灌注的研究中，用TIR-2特效配體預處理的小鼠可降低其腦梗范圍。Dong等實驗中發現預處理的野生型小鼠其左心室舒張壓恢復率明顯提高，心功能亦明顯改善。用TLR2興奮劑Pam3 CSK4可復制出小鼠缺血預適應的效果，但TIR-2缺陷小鼠則不能，Mersmann等也發現，通過Pam3 CSK4預處理可減少心梗面積和肌鈣蛋白T的釋放。Ponce等發現美洲錐蟲病患者的心臟細胞上TLR2的表達高于正常人，TIR2激活后促進IL-6的分泌，發揮抗凋亡作用。缺血再灌注損傷后，采用LPS預處理可激活Pl3k/AKT信號通路減輕心肌細胞凋亡和心肌梗死面積。IPS預處理培養的心肌細胞后激活PI3k/AKT' ERK、IKB-β發揮抗凋亡效應來減輕心肌細胞缺氧再復氧損傷，IPS預處理未改善TIR4和MyD88基因敲除小鼠的心功能，提示TIR4和MyD88參與該機制。缺氧再復氧損傷的心肌細胞釋放外源性配體HSP60經TIR4/NF-KB通路減輕心肌細胞凋亡。大量的研究提示預適應能夠減輕再灌注損傷，但由于其臨床應用受到限制，近年來心肌缺血后適應越來越受到人們的追捧，不少文獻肯定了其減輕再灌注損傷的作用，缺血后適應的分子機制成為研究的熱點，近期的一項國內研究發現，通過閉塞大鼠的大腦中動脈形成腦梗死，分別在閉塞2、3、4、4.5和6小時后給予5個循環的缺血（lOs）——灌注（lOs），結果發現缺血2、3、4小時的三組，其腦梗死面積、腦水腫程度、腦功能都得到一定程度的改善，實時RT-PCR檢測發現TIR2、TIR4的表達亦減少，所以猜想Toll樣受體也可能參與心肌缺血后適應的分子機制，其基礎就在于TIR在MIRI中起著重要作用，而缺血后適應使TLR的損傷性配體減少，減弱TIR信號通路的激活，進一步減輕MIRI，但目前對兩者的相關性研究較少，需進一步研究證實。

4 展望

大量的文獻研究提示Toll樣受體（尤其疋TIR2、TIR4）參與介導心肌的缺血/再灌注損傷，關于其分子機制有了一定認識，但仍然有許多疑問沒有解釋清楚，如感染時，Toll樣受體可以保護心臟并限制組織損傷，為什么在非感染刺激時TIRs會增加損害性的炎癥反應，并加重組織損傷，由此可見免疫系統的激活具有“雙刃”效應 完整的免疫系統在機體的許多保護途徑中是必需的，而長期的免疫激活也可能激活“不利”的信號級聯反應而致疾病發展。當前面臨的主要挑戰就是在限制有害的先天免疫反應的同時如何保持足夠、適當的先天免疫防御機制。因此研究能否將后適應與優化TIR完美結合，從而探尋安全、有效的減輕再灌注損傷的方法還需要進一步深入研究。endprint