試論五味子木脂素對發生氧化損傷心肌細胞的保護作用

唐莉麗 高 濱 鄭云恒

臨床研究發現，冠心病患者在發病的中、晚期，其心臟會發生血液灌注，這種情況會使其心肌細胞發生氧化損傷，進而可使其心肌細胞的功能明顯減弱，從而引起心力衰竭和心肌梗死，危及其生命安全[1]。因此，如何保護發生氧化損傷的心肌細胞、促進其功能的恢復是治療冠心病的關鍵。近年來的臨床研究發現，五味子木脂素對發生氧化損傷的心肌細胞具有很強的保護作用[2]。為了進一步研究五味子木脂素對發生氧化損傷心肌細胞的保護作用，我們進行了本次研究。現將研究結果報告如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本次實驗使用的動物為10只SD乳鼠（雌雄不限）。這10只乳鼠均由長春高新區醫學動物實驗研究中心提供，其出生時間均在3天以內。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗用的試劑、藥品和儀器 本次實驗使用的試劑、藥品和儀器包括超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒（這三種試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產）、DMEM培養基（由北京拜爾迪生物技術有限公司生產）、五味子木脂素（由北華大學林學院提供）、電子分析天平（由北京賽多利斯儀器系統有限公司生產）、超凈工作臺（由蘇州凈化設備有限公司生產）、高速低溫離心機（由長沙易達儀器有限公司生產）、680型全自動酶標儀（由美國BIO-RAD公司生產）、倒置顯微鏡及照相系統（由麥克奧迪有限公司生產）。

1.2.2 心肌細胞原代培養方法 該培養方法參照文獻[3]進行。

1.2.3 對用不同濃度H2O2處理的發生氧化損傷的心肌細胞進行研究

1.2.3.1 實驗分組 ①對照組：對該組模型進行正常培養。②H2O2Ⅰ組：在進行心肌細胞原代培養的基礎上，使用H2O2對該組模型進行預處理，使其心肌細胞原代培養液的濃度達到200μmol/L。③H2O2Ⅱ組：使用②中的方法將該組模型心肌細胞原代培養液的濃度調節至400μmol/L。④H2O2Ⅲ組：使用②中的方法將該組模型心肌細胞原代培養液的濃度調節至600μmol/L 。

1.2.3.2 實驗方法 用MTT比色法測定心肌細胞的活力，具體的方法是：①吸取細胞培養孔內的上清液，用PBS對其清洗2次。②在每個培養孔內加入無血清的DMEM培養液 200μl和 MTT溶液 (5mg/ml)20μl，在 37℃的環 境中進行孵育4h。③棄去孔內的培養液，在每個培養孔加入150μl的DMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解。④在酶聯免疫檢測儀上測定各培養孔的吸光度OD490值（選擇的波長為490nm，），然后分別于H2O2發生作用后的lh、3h、6h、12h和18h再次測定其吸光度OD490值。⑤取五味子木脂素50g，向其中加入數滴細胞培養液，用高壓乳勻儀對其進行處理，制成SCL乳劑。

1.2.4 進行對心肌細胞氧化損傷保護作用量效關系的實驗

1.2.4.1 實驗分組 ①對照組：對該組模型進行正常培養。②H2O2組：在進行心肌細胞原代培養的基礎上，使用H2O2對該組模型進行預處理，使其心肌細胞原代培養液的濃度達到400μmol/L。③SCLⅠ組：使用SCL對該組模型進行預處理，使其心肌細胞原代培養液的濃度達到2.5×10-5g/L，④SCLⅡ組：使用③中的方法將該組模型心肌細胞原代培養液的濃度調節至5×10-5g/L。⑤SCLⅢ組：使用③中的方法將該組模型心肌細胞原代培養液的濃度調節至1×10-4g/L。

1.2.4.2 實驗方法 按照1.2.3.2中的方法分別于H2O2發生作用后的lh、3h、6h、12h、18h測定各組模型的吸光度OD490值。

1.2.5 進行發生氧化損傷的心肌細胞對酶學影響的實驗

1.2.5.1 實驗分組 ①對照組：對該組模型進行正常培養。②H2O2組：在進行心肌細胞原代培養的基礎上，使用H2O2對該組模型進行預處理，使其心肌細胞原代培養液的濃度達到400μmol/L，并連續處理3h。③SCL組：使用SCL對該組模型進行預處理，使其心肌細胞原代培養液的濃度達到5×10-5g /L，并連續處理12h。

1.2.5.2 實驗方法 分別用上清乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物岐化酶（SOD)和丙二醛（MDA）測定各組模型細胞的活性

1.3 統計學處理

我們使用SPSS13.0軟件包對本次實驗數據進行處理，計量資料用（x± s ）表示，采用t檢驗，計數采用χ2檢驗，用P＜0.05表示差異具有統計學意義[3]。

2 結果

2.1 進行H2O2處理對心肌細胞的影響

①在H2O2作用1h后，對照組模型、H2O2Ⅰ組模型、H2O2Ⅱ組模型和H2O2Ⅲ組模型的吸光度分別為0.433±0.020、0.453±0.030、0.311±0.012 和 0.278±0.203，差異有統計學意義（P＜0.01）。②在H2O2作用3h后，對照組模型、H2O2Ⅰ組模型、H2O2Ⅱ組模型和H2O2Ⅲ組 模 型 的 吸 光 度 分 別 為 0.442±0.047、0.391±0.121、0.241±0.043和 0.179±0.016， 差異有統計學意義（P＜0.01）。③在H2O2作用6至18h后，對照組模型、H2O2Ⅰ組模型、H2O2Ⅱ組模型和H2O2Ⅲ組模型的吸光度 分 別 為 0.477±0.032、0.078±0.013、0.063±0.084和0.041±0.007，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 進行對心肌細胞氧化損傷保護作用量效關系實驗的結果

在H2O2作用12至18h后，對照組模型、H2O2組模型、SCLⅠ組模型、SCLⅡ組模型和SCLⅢ組模型的量效關系分別為 0.397±0.017、0.063±0.009 、0.071±0.001、0.072±0.004、0.073±0.002，差異有統計學意義（P ＜0.01）。

2.3 進行SCL預處理對發生氧化損傷心肌細胞酶學的影響

①與對照組模型相比，H2O2組模型培養基中的LDH含量、MDA含量和SOD含量無顯著差異(P＞0.05)。②與對照組模型相比，SCL組模型培養基中的LDH含量、MDA含量和SOD含量有顯著差異（P＜0.01）。詳情見表1。

表3 進行SCL預處理對發生氧化損傷心肌細胞酶學的影響

3 討論

臨床研究發現，心肌缺血是冠心病患者最主要的臨床表現。而心肌在發生缺血后，心臟就會出現再灌注的現象。病理學研究發現，心肌在發生再灌注時會產生大量的氧自由基。這些氧自由基會對心肌細胞造成傷害，從而影響心肌細胞的功能[4]。五味子木脂素是從中藥五味子中提取出的一種藥物成分。該成分能夠激活人體內的SOD（一種存在于細胞質和線粒體內的金屬蛋白酶，具有清除氧自由基的作用），從而有效地清除心肌細胞中的氧自由基，保護發生氧化損傷的心肌細胞，促進其功能的恢復[5]。

本次研究的結果說明，SCL對發生氧化損傷的心肌細胞具有明顯的保護作用，而且其濃度與作用呈線性關系。SCL之所以具有此作用，可能與其能夠激活人體內的SOD有關。

[1] Murphy E, Steenbergen C. Meehanisms underlying aeute Proteetion from eardiae isehemia-reperfusion injury [J]Physiol Rev，2008，88(2)：581-609.

[2] 馬育軒，黃艷霞，周海純，等.五味子現代藥理及臨床研究進展[J].中醫藥信息，2014（10）：125-126.

[3] 王娜，關鵬，段相林等，新生大鼠心肌細胞原代培養方法的改進[J].河北師范大學學報，2007,31(2)：256-259.

[4] Hoffman JW Jr, Gilbert TB,Poston RS, etal. Myocardial reperfusion injury: etiology, mechanisms, and therapies[J].J Extra Corpor Technol, 2004,36(4)：391-411.

[5] 高嘯巍，劉苑，等.毛莨總苷對大鼠離體心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].中藥材，2014（08）：1430-1433.