復原再造膠囊對全腦缺血小鼠學習記憶及腦內氧化應激的影響

李雅莉，趙　玲，張　麗，張　蘭，李　林

(1.首都醫科大學宣武醫院藥物研究室；2.北京市老年病醫療研究中心；3.北京市神經藥物工程研究中心，北京　100053)

復原再造膠囊對全腦缺血小鼠學習記憶及腦內氧化應激的影響

李雅莉，趙玲，張麗，張蘭，李林

(1.首都醫科大學宣武醫院藥物研究室；2.北京市老年病醫療研究中心；3.北京市神經藥物工程研究中心，北京100053)

【摘要】目的研究中藥新復方制劑復原再造膠囊對全腦缺血小鼠學習記憶功能的影響及其與氧化應激相關的作用機制。方法采用雙側頸總動脈夾閉/再灌注致全腦缺血小鼠模型，以Morris水迷宮和跳臺試驗檢測小鼠學習記憶能力，尼氏染色法觀察海馬神經元的病理變化，黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法分別測定腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。結果全腦缺血/再灌注引起小鼠學習記憶能力受損，海馬CA1區神經元數量減少，大腦皮層SOD活性降低，MDA含量增加。復原再造膠囊于造模后灌胃給藥14 d，能明顯改善全腦缺血小鼠的學習記憶能力，減少海馬區神經元的損傷和丟失，提高大腦皮層SOD活性，降低MDA含量。結論復原再造膠囊可通過抑制全腦缺血再灌注引起的氧化應激而改善學習記憶功能，提示該藥具有治療缺血性腦血管病的應用前景。

【關鍵詞】復原再造膠囊；中藥；全腦缺血；學習記憶功能；神經元；氧化應激；小鼠

腦血管病具有高發病率、高致殘率、高致死率等顯著特點，已經成為繼心血管病、腫瘤之后嚴重威脅人類生命的第三大類疾病，給患者及社會帶來沉重的精神和經濟負擔[1，2]。目前臨床普遍采用血管內介入及靜脈溶栓法治療缺血性腦血管病，這一過程中不可避免出現血管再通后的缺血再灌注損傷問題。缺血后的再灌注損傷對人類健康的危害極大，快速恢復腦組織的血液灌注是救治腦缺血的前提[3，4]，因此開發有效的神經保護劑成為基礎與臨床學者共同關注的熱點。

復原再造膠囊是由黃芪、赤芍、葛根、蒺藜、秦艽等組成的中藥復方制劑，具有補氣活血、祛風通絡、除煩解肌、平肝解郁的功效。本文研究了復原再造膠囊對全腦缺血小鼠學習記憶功能的影響及其與抗氧化應激相關的作用機制，為臨床治療缺血性腦血管病提供實驗依據。

1材料和方法

1.1實驗動物及實驗環境

ICR小鼠，雌雄兼用，無特殊病原體(specific-pathogen free, SPF)級，體重(30±3)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK(京)2002-0003。飼養于首都醫科大學宣武醫院實驗動物室SPF級動物房，許可證號：SYXK(京)2000-0043。手術前夜禁食、不禁水。

1.2藥物與儀器

復原再造膠囊：天力正元醫藥技術開發有限公司提供。中藥陽性對照藥：人參再造丸，北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠生產(國藥準字Z11020060)。西藥陽性對照藥：尼莫地平，正大青春寶藥業有限公司生產(國藥準字H33022285)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Folin酚試劑由北京鼎國生物試劑公司提供；其他藥品與試劑，均為市售分析純。

Morris水迷宮及其分析軟件、跳臺反應箱，均由中國醫學科學院藥物研究所提供；ASE-620型恒溫冷凍切片機，美國山盾公司產品；日本Olympus BH-2型光學顯微鏡；美國Image Plus 4.0 圖像分析軟件；HP8453型紫外可見分光光度計，美國惠普公司產品。

1.3分組與給藥

小鼠適應性飼養1周后進行全腦缺血造模手術，術后隨機分為7組：假手術組，模型組，復原再造膠囊小劑量組(2 g生藥/kg)、中劑量組(4 g生藥/kg)、大劑量組(8 g生藥/kg)，尼莫地平組(0.02 g/kg)，人參再造丸組(1 g/kg)。造模后1 h開始灌胃給藥，每日1次，連續給藥14 d，假手術組、模型組給予等容積生理鹽水。

1.4小鼠全腦缺血/再灌注模型制備[5]

全部模型制作在屏障環境下進行，室溫保持在(23～25)℃，相對濕度60%，以電熱毯保持體溫在(37.5±0.5)℃。小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，分離雙側頸總動脈，距尾尖部1 cm斷尾放血約0.4 mL。即刻用動脈夾夾閉雙側頸總動脈，斷血2次，每次15 min，中間再灌10 min。最后消毒，縫合肌肉皮膚，腹腔注射硫酸慶大霉素。假手術組不夾閉，不放血，其余同模型組。

1.5行為學檢測

1.5.1Morris水迷宮試驗[6]:定向航行實驗：用于測定小鼠的空間學習記憶能力。各組小鼠每天訓練2次，共訓練4 d。第1天訓練時，所選入池位置為平臺所對及相鄰象限，將小鼠于象限邊緣1/2弧度處頭朝池壁入水，經120 s未找到平臺者，將其引領至平臺，放置30 s，引導其學習記憶。第2～4天重復如上操作，記錄小鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)和游泳距離，將各組小鼠Morris 水迷宮作業中第2～4天的平均逃避潛伏期和平均游泳距離作為衡量其學習記憶能力的指標，并計算小鼠的游泳速度判斷其有無肢體運動障礙。

空間探索實驗：用于測定小鼠的空間位置記憶能力。第5天撤除平臺，將小鼠從任選的非平臺象限，面向池壁放入水中，記錄1 min內小鼠在池中各象限的游泳時間和游泳距離，然后分析小鼠在平臺象限游泳時間占總時間的百分比(時間%)、在平臺象限游泳距離占總游泳距離的百分比(游泳距離%)。

1.5.2跳臺試驗[7]:檢測小鼠的被動回避記憶能力。第1天進行訓練，將各組小鼠分別放入跳臺反應箱中適應3 min，通以36 V交流電，訓練5 min。24 h后將小鼠放于銅柵上通電，記錄第一次跳上跳臺的時間(反應期)、第一次跳下的時間(潛伏期)。

1.6尼氏染色

用于觀察神經元形態。小鼠灌殺后將腦組織取出，儲存于后固定液中，之后制作成10 μm厚的冰凍切片，焦油固紫工作液中染色(15～30) min，蒸餾水洗去浮色后，依次置入70%、80%、95%的酒精中分色，至顯微鏡下觀察尼氏顆粒清晰。切片入特殊分色液退背景。酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.7腦組織SOD活性和MDA含量測定

小鼠大腦皮層稱重后，按1∶10加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，勻漿。按照試劑盒說明書，分別采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

1.8統計學方法

2結果

2.1復原再造膠囊對全腦缺血小鼠空間學習記憶能力的影響

采用Morris水迷宮法測定小鼠空間學習記憶能力。定向航行試驗的結果顯示，與假手術組相比，腦缺血模型小鼠第2～4天的逃避潛伏期、3 d平均逃避潛伏期均明顯延長(P<0.01)；復原再造膠囊中、大劑量灌胃給藥能明顯縮短腦缺血小鼠的3 d平均逃避潛伏期(P<0.05，P<0.01)(表1)。模型小鼠第2～4天的游泳距離、3 d平均游泳距離均明顯延長(P<0.05，P<0.01)；復原再造膠囊中、大劑量組3 d平均游泳距離顯著縮短(P<0.01)(表2)。對各組游泳速度進行比較，發現各組之間游泳速度無明顯差異，說明各組小鼠逃避潛伏期的差異與游泳速度無關，主要與學習記憶能力的變化有關。

表1　復原再造膠囊對全腦缺血小鼠Morris水迷宮逃避潛伏期的影響(s)

FYZZ：復原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。M±SD；##P<0.01, 與假手術組相比；*P<0.05,**P<0.01與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-Shen-Zai-Zao Wan. M±SD；##P<0.01,vs. sham group；*P<0.05,**P<0.01,vs. model group.

表2　復原再造膠囊對全腦缺血小鼠Morris水迷宮游泳距離的影響(cm)

FYZZ：復原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。M±SD；#P<0.05，##P<0.01，與假手術組相比；*P<0.05,**P<0.01, 與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-shen-zai-zao wan. M±SD；#P<0.05，##P<0.01,vs. sham group；*P<0.05,**P<0.01,vs. model group.

在撤除平臺后的空間探索試驗中，與假手術組相比較，腦缺血模型小鼠在平臺象限的游泳時間和游泳距離均明顯縮短(P<0.05，P<0.01)；復原再造膠囊大劑量組在平臺象限的游泳時間和游泳距離較腦缺血模型組顯著延長(P<0.05)(表3)。

2.2復原再造膠囊對全腦缺血小鼠被動回避記憶能力的影響

應用跳臺試驗觀察小鼠被動回避記憶能力。結果顯示，與假手術對照組相比，腦缺血模型小鼠的反應期明顯延長(P<0.01)，潛伏期縮短(P<0.05)；復原再造膠囊各劑量能明顯縮短腦缺血小鼠的反應期(P<0.01)，延長潛伏期(P<0.01)(表4)，表明被動回避記憶能力增強。

2.3復原再造膠囊對全腦缺血小鼠海馬神經元存活的影響

應用尼氏染色方法觀察海馬神經元的變化。與假手術組相比，腦缺血模型組小鼠海馬CA1區尼氏體數量減少、染色變淺，陽性細胞數量、面積和灰度均顯著減低(P<0.05)，表明有明顯的神經元損傷和丟失；復原再造膠囊各組均可減少腦缺血小鼠海馬CA1區尼氏體的丟失，增加陽性細胞數量、面積和灰度(P<0.05)，表明海馬神經元的損傷和丟失明顯減輕(表5、圖1見封二)。

表3　復原再造膠囊對全腦缺血小鼠Morris水迷宮空間探索試驗的影響±s)

FYZZ：復原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。#P<0.05，##P<0.01, 與假手術組相比；*P<0.05, 與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-Shen-Zai-Zao Wan.#P<0.05，##P<0.01,vs. sham group；*P<0.05,vs. model group.

表4　復原再造膠囊對全腦缺血小鼠跳臺試驗的影響±s)

FYZZ：復原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。#P<0.05，##P<0.01, 與假手術組相比；**P<0.01, 與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-Shen-Zai-Zao Wan.#P<0.05，##P<0.01,vs. sham group；**P<0.01,vs. model group.

表5　復原再造膠囊對全腦缺血小鼠海馬CA1區神經元的影響(尼氏染色)±s)

FYZZ：復原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。#P<0.05，與假手術組相比;*P<0.05，與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-Shen-Zai-Zao Wan.#P<0.05,vs. sham group；**P<0.01,vs. model group.

表6　復原再造膠囊對全腦缺血小鼠大腦皮層SOD活性和MDA含量的影響±s)

FYZZ：復原再造膠囊；RSZZ：人參再造丸。#P<0.05，##P<0.01，與假手術組相比；*P<0.05，**P<0.01，與模型組相比。

Note.FYZZ: Fu-Yuan-Zai-Zao capsule; RSZZ: Ren-Shen-Zai-Zao Wan.#P<0.05,##P<0.01,vs. sham group；*P<0.05,**P<0.01,vs. model group.

2.4復原再造膠囊對全腦缺血小鼠腦組織氧化應激的影響

與假手術組相比，腦缺血模型小鼠大腦皮層SOD活性明顯降低(P<0.01)，脂質過氧化代謝產物MDA含量升高(P<0.05)；復原再造膠囊各劑量能明顯升高腦缺血小鼠大腦皮層SOD活性(P<0.05，P<0.01)，降低MDA含量(P<0.05)(表6)。

3討論

良好的血液供應對于維持機體正常的組織代謝具有重要意義。雙側頸總動脈反復缺血再灌結合尾部放血降壓制備的小鼠腦缺血模型，能夠較好地模擬臨床上腦血管嚴重狹窄或阻塞合并血液低灌流引起的腦循環障礙，造成腦組織缺血性損傷，可用于探討人類缺血性中風的發病規律，評價抗缺血性中風藥物的療效。本研究結果顯示，全腦缺血再灌注導致小鼠出現空間學習記憶功能和被動回避記憶能力減低；腦缺血術后灌胃給予復原再造膠囊，能夠明顯改善模型小鼠的學習記憶能力，提示該藥可能有利于臨床治療腦缺血致認知功能障礙。

全腦缺血損傷最主要的表現是遲發性神經元死亡，海馬對缺血的反應最為明顯，海馬中又以CA1區為缺血易損區[8]。尼氏小體是分布于神經元軸突和軸丘以外胞漿中的一種嗜堿性顆粒，其化學成分為核糖核酸及蛋白質，是一種含鐵質的核酸蛋白。正常情況下，神經元的尼氏小體有其特定的數量和特征性的形態分布。在腦缺血等病理狀態下，神經元變性時，尼氏小體的變化十分敏感，逐漸由塊狀或顆粒狀變為粉末狀，甚至消失。本實驗中復原再造膠囊能夠明顯減輕小鼠全腦缺血所致海馬CA1區神經元的尼氏小體減少，表明能夠使存活神經元數量增多，這可能是該藥改善腦缺血動物學習記憶功能的作用機制之一。

腦缺血再灌注后導致機體氧自由基增高與清除系統失去平衡，脂質過氧化作用增強，可導致大量的自由基無法清除，造成細胞膜結構受損、繼而導致神經元損傷和死亡。體內存在的自由基消除系統如SOD能夠清除超氧陰離子，是生物體內重要的抗氧化酶。SOD活性降低可導致體內氧自由基含量增高，引起脂質過氧化，造成細胞損傷[9]。本研究發現小鼠腦缺血后大腦皮層SOD活性降低，脂質過氧化代謝產物MDA含量增高；復原再造膠囊能夠增高腦內SOD活性，減低MDA含量，表明該藥具有抗氧化應激的作用，這可能是其減少神經元損傷和丟失的作用機制之一。

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〔修回日期〕2015-07-01

研究報告

Fu-Yuan-Zai-Zao capsule improves learning and memory ability

through inhibiting oxidative stress in global brain ischemic mice

LI Ya-li, ZHAO Ling, ZHANG Li, ZHANG Lang, LI Lin

(1. Department of Pharmacology, Xuanwu Hospital of Capital Medical University; 2. Beijing Geriatric Medical Research Center;

3. Beijing Engineering Research Center for Nervous System Drugs, Beijing 100053, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Fu-Yuan-Zai-Zao capsule, a novel compound drug of traditional Chinese medicine, on learning and memory ability and its mechanism related to oxidative stress induced by global brain ischemia. Methods The mouse model of global brain ischemia was established by bilateral common carotid arteries occlusion and reperfusion. The learning and memory ability was measured by Morris water maze and step down tests. Nissl staining was used to detect the pathological changes in the hippocampal neurons. The activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) were evaluated by xanthinoxidase assay and thiobarbituric acid method, respectively. Results The global brain ischemia and reperfusion induced an impairment of learning and memory function, a decrease in the number of neurons in the hippocampal CA1 region, a decline in SOD activity and an increase in MDA content in the cerebral cortex of mice. Intragastrical administration of Fu-Yuan-Zai-Zao capsule for 14 d after brain ischemic surgery significantly improved the learning and memory impairment, increased the number of neurons in the hippocampal CA1 region, elevated SOD activity and reduced MDA content in the cerebral cortex. ConclusionsFu-Yuan-Zai-Zao capsule ameliorates the learning and memory impairment through inhibiting oxidative stress induced by global brain ischemia in mice. The results suggest that Fu-Yuan-Zai-Zao capsule may have future application in the treatment of ischemic cerebrovascular diseases.

【Key words】Fu-Yuan-Zai-Zao capsule, Chinese traditional medicine; Global cerebral ischemia; Learning and memory ability; Neuron; Oxidative stress; Mouse

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.001

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0001-05

[通訊作者]李林(1953-)，女，研究方向：神經藥理學、中藥藥理學。E-mail: linlixw@126.com。

[作者簡介]李雅莉(1972-)，女，研究方向：神經藥理學。E-mail: yll200014@126.com。

[基金項目]北京市科技專項(Z131102002813066)，北京市高層次衛生人才計劃項目(2011-1-7，2014-2-014)。