微生物利用廢棄油脂合成PHA的研究進展

劉慧,任連海

(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院,北京 100037)

微生物利用廢棄油脂合成PHA的研究進展

劉慧,任連海

(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院,北京 100037)

摘要:指出了聚羥基脂肪酸酯(PHA)是細菌在碳源充足、氮源缺乏的情況下產(chǎn)生的作為胞內(nèi)碳源和能源儲存物的生物聚酯,PHA作為一種可降解高分子材料,可替代傳統(tǒng)塑料。然而高于傳統(tǒng)塑料5~10倍的生產(chǎn)成本是限制PHA大規(guī)模應(yīng)用的主要原因。以廢棄油脂為碳源生產(chǎn)PHA,不僅能有效降低PHA成本,同時可以為廢棄油脂的資源化提供合理的途徑。綜述了近年來廢棄油脂用于PHA合成的最新進展。

關(guān)鍵詞:聚羥基脂肪酸酯(PHA);廢棄油脂;微生物合成

1引言

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是廣泛存在于微生物體內(nèi)的一類高分子生物聚酯,在生物體內(nèi)主要作為碳源和能量的貯藏物質(zhì),如圖1所示。PHA與傳統(tǒng)的、以石油為原料合成的塑料具有相似的材料學(xué)性質(zhì),但可以用可再生的資源合成,并且具有生物可降解性、生物相容性和不依賴化石資源等特性,可以完全降解進入自然界的生態(tài)循環(huán),具有廣闊的應(yīng)用前景。因此,通過生物技術(shù)利用可再生資源生產(chǎn)PHA,獲得生物可降解聚合物以代替源自石油的普通塑料,受到相關(guān)領(lǐng)域研究者的普遍關(guān)注。

圖1　細胞內(nèi)的PHA

2PHA研究現(xiàn)狀

PHA在20世紀(jì)20年代就被發(fā)現(xiàn),當(dāng)時研究者發(fā)現(xiàn)其能被蘇丹染料染色,可溶于氯仿[1],但未給其命名。1926年,Lemoigne[2]在巨大芽抱桿菌中,也發(fā)現(xiàn)了此類物質(zhì),并首次給這類物質(zhì)命名。隨后研究發(fā)現(xiàn),很多菌株都能夠合成PHA。在這一階段,還研究了PHB的天然顆粒提取及提取的PHB的功能[3],并且對PHB合成和分解代謝[4]進行了初步研究。1974年,Wallen和Rohwedder[5]發(fā)現(xiàn)了其它PHA,標(biāo)志PHA研究進入發(fā)展階段。其他PHA的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了人們研究PHA的興趣,中長鏈PHA開始被人們廣泛認識[6,7]。在以后的20多年里發(fā)現(xiàn)了多種各種各樣、性能各異的PHA。在這一時期,PHA的商業(yè)應(yīng)用研究也開始起步,第一個商業(yè)化產(chǎn)品3HB和3HV的異聚物也在這一時期誕生了。在各種各樣的細菌中都檢測到了PHA的存在。PHA合酶基因[8]的克隆標(biāo)志著PHA的研究進入了迅猛發(fā)展階段。分子生物學(xué)的發(fā)展為在分子水平研究PHA提供了可能。在這一發(fā)展階段,研究者們主要進行的是對合成這些聚酯分子生物學(xué)手段完美的應(yīng)用于PHA基因的克隆、缺失突變、嵌合研究中,提高了PHA的產(chǎn)量、產(chǎn)生了新型PHA。聚羥基脂肪酸酯作為一種可替代傳統(tǒng)塑料的新型材料已被國內(nèi)外學(xué)者廣泛研究,國內(nèi)的研究主要集中在利用基因修飾合成PHA[9~11],利用活性污泥合成PHA[12,13],以及PHA在微生物細胞內(nèi)的生物合成途徑和合成PHA的酶的研究[14]。

參考文獻:

[1] 約翰·卡莫迪.高性能建筑用窗[M].劉正權(quán),譯.北京:中國建材工業(yè)出版社,2012(1).

[2] 羅藝,黃圻,劉忠偉.建筑門窗[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2009(8).

[3] 吳蔚,雷持平.夏熱冬冷地區(qū)居住建筑節(jié)能窗傳熱系數(shù)和遮陽系數(shù)優(yōu)化研究[J].墻材革新與建筑節(jié)能,2010(2).

[4] 郭紅,桑謙.鋁合金窗和塑料窗節(jié)能性能的比較及設(shè)計選用的基本原則[J].建筑科學(xué),2006(2).

[5] 班廣生.建筑節(jié)能窗的功能化發(fā)展趨勢[J].新型建筑材料,2004(5).

[6] 何水清,魏德林.節(jié)能窗影響因素與中空玻璃窗推廣應(yīng)用[J].門窗,2007(5).

[7] 陳建峰,孫劍波.建筑節(jié)能玻璃膜的應(yīng)用與建筑節(jié)能效果分析[J].住宅產(chǎn)業(yè),2013(4).

[8] 張云霞,朱琨.節(jié)能窗的研究應(yīng)用現(xiàn)狀及存在問題探討[J].能源與環(huán)境,2008(3).

3PHA的結(jié)構(gòu)及應(yīng)用

PHA具有多種單體,其結(jié)構(gòu)是一種帶有多羥基的鏈?zhǔn)骄酆衔?根據(jù)其支鏈的結(jié)構(gòu),進行不同的命名。其結(jié)構(gòu)通式為如圖2所示。

圖2　PHA的分子結(jié)構(gòu)

其中n=1、2、3或4;通常m=1。n為聚合物單體的數(shù)目,多為100~3000,決定分子量的大小。R代表側(cè)鏈,可為飽和或不飽和、直鏈或含側(cè)鏈及取代基的烷基。根據(jù)單體中的碳原子數(shù),可將PHA分為兩類:短鏈PHA,單體中含有3~5個碳原子;中長鏈PHA,單體中含有6~14個碳原子[15]。根據(jù)PHA單體成分是否唯一,也可將PHA分為均聚物和共聚物。在所有已發(fā)現(xiàn)的PHA中,除PHB、PHV為均聚物外,其余皆為共聚物。不同結(jié)構(gòu)的PHA是在與其單體結(jié)構(gòu)相關(guān)的底物培養(yǎng)中獲得的,這使得合成多種不同結(jié)構(gòu)的PHA成為可能。

自1926 年Lemoigne第一次在芽抱桿菌中發(fā)現(xiàn) PHB,到目前為止,研究人員已經(jīng)在300 多種細菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)了近百種不同脂肪酸構(gòu)成的 PHA單體,這些單體涵蓋了碳原子數(shù)從3到16的具有飽和或不飽和鍵或支鏈的脂肪族以及芳香族3-羥基脂肪酸[16-18],幾種常見的PHA分子式見表1。

表1　PHA的單體結(jié)構(gòu)

PHA具有良好的生物相容性能、生物可降解性、紫外穩(wěn)定性、生物組織相容性和塑料的熱加工性能、光學(xué)活性、壓電性、抗潮性、低透氣性等特殊性能,在日常生活、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境保護等各個領(lǐng)域有著巨大的研究價值:①可降解包裝材料,由于PHA是類似聚丙烯的可降解材料,因此可應(yīng)用于制造可拋棄型的材料用具,如手袋,包裝膜,容器等。②醫(yī)藥行業(yè),PHA具有生物可降解性和生物相容性,可用作緩釋材料,當(dāng)其作為藥物基質(zhì)包埋藥物植入人體后,隨著藥物釋放,能降解為3HA,而3HA在人體中是一種正常存在物質(zhì),可被人體自行代謝,而不有任何毒副作用。PHA還可以用來生產(chǎn)手性單體。手性藥物的天然存在性使手性藥物使用起來更安全有效且使用劑量更小[19]。③組織工程,生物相容性、生物可降解性、無毒性、無刺激性、無免疫原性、不溶血及無致突變性、壓電性等特點使PHA在組織工程中廣泛應(yīng)用。比起傳統(tǒng)的組織工程材料,PHA的無毒可降解性使得患者在進行手術(shù)時更加安全,且能減少再次創(chuàng)傷、減輕患者再次疼痛。④壓電性,PHB經(jīng)過80℃碾壓后再經(jīng)熱處理制成單軸定向的箔和薄膜后在45℃增加拉力或剪應(yīng)力,使其呈現(xiàn)表面壓電特性,即可應(yīng)用于壓力測試儀,點火器,診聽器,聲學(xué)儀器等儀器。⑤生物能源,PHA作為一種聚酯本身就具有可燃性,當(dāng)其經(jīng)甲酯化處理PHA即得到3-羥基脂肪酸甲酯,可以直接作為生物燃料,燃燒熱稍低于乙醇[20]。⑥其他應(yīng)用,PHA還具有光學(xué)活性,可應(yīng)用于色譜中分離手性物質(zhì)。此外,PHA可在農(nóng)業(yè)、環(huán)境中用作指示劑等,具有廣泛應(yīng)用。

4利用廢棄油脂合成PHA

雖然PHA聚合物具有在自然條件下能被完全降解的優(yōu)點,可作為傳統(tǒng)塑料的替代物。但時至今日,PHA并沒有得到大規(guī)模的應(yīng)用。其中最主要的原因是生產(chǎn)PHA的成本太高。目前PHA生產(chǎn)主要依賴于微生物發(fā)酵,在微生物發(fā)酵合成PHA的所有發(fā)酵條件因素中,底物是一個重要因素,其成本占到總成本的28%~50%[21]。采用廉價底物將在很大程度上降低PHA的生產(chǎn)成本。利用廢棄油脂合成PHA既可以解決廢棄油脂處理不當(dāng)帶來的廢水、廢氣等環(huán)境污染的問題,又可以降低PHA的生產(chǎn)成本,使其獲得廣泛應(yīng)用。

4.1　生物柴油副產(chǎn)物

近年來,石油危機、能源緊缺的問題日益嚴(yán)峻,世界各國正積極研發(fā)太陽能、風(fēng)能、水能、生物質(zhì)能等可再生的替代能源。生物柴油作為一種極有前景的可再生能源,受到全世界學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的普遍關(guān)注。然而,在生產(chǎn)生物柴油的過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物,主要包括脂肪酸甲酯、甘油、游離脂肪酸、水、低碳醇(甲醇或乙醇)和微量的鹽(如K2SO4,NaCl)等[22~23]。其中僅甘油一種產(chǎn)物就可達到生物柴油總產(chǎn)量的1/10。生物柴油副產(chǎn)物是非常好且便宜的PHA合成的原料。以生物柴油副產(chǎn)物為原料合成PHA,對于解決生物柴油副產(chǎn)物過度積累的問題具有重要意義,因此利用生物柴油副產(chǎn)物甘油合成PHA受到廣泛關(guān)注。

Nikel等以甘油為碳源,利用重組大腸桿菌arcA突變株,添加1.78 g/ L水解酪氨酸合成了PHB[24]。Koller等最先利用還未被鑒定的耐高滲透壓的微生物以生物柴油副產(chǎn)物為碳源在未添加任何前體的情況下合成P(3HB-co-3HV)[25]。Mothes等利用純甘油,以Paracoccus denitrificans和Cupriavidus necator JMP 134為出發(fā)菌株合成PHB,PHB占細胞干重的70%。當(dāng)以含有5.5% NaCl的粗甘油為碳源時,PHB含量降低至48%,這主要由于氯化鈉高滲作用引起的[23]。Cavalheiro等以純甘油為底物,利用Cpriavidus necator DSM 545生產(chǎn)PHB,最大細胞干重是82.5 g/L,PHB產(chǎn)量可達細胞干重的62%,產(chǎn)率為1.1~1.5g PHB L-1h-1。當(dāng)以廢甘油為底物時,PHB產(chǎn)率為0.84 gPHBL-1h-1,細胞干重為68.8g/L。生物量濃度在PHB積累時起到關(guān)鍵作用,降低生物量的濃度,PHB含量可達細胞干重的50%,PHB產(chǎn)率可達1.1gPHB L-1h-1[26]。Mazur等以Cupriiavidus necator為出發(fā)菌株,在添加了米糠油制備的生物柴油副產(chǎn)物的礦物鹽培養(yǎng)基中,30℃,150rpm培養(yǎng)24h,合成了PHB[27]。

4.2　餐廚廢油

餐廚廢油包括煎炸廢油、泔水油和地溝油等源自于餐飲業(yè)的廢油脂,成分主要是烹調(diào)用植物油和食品中動物油脂,化學(xué)組成主要為脂肪酸甘油酯[28]。

煎炸廢油是指餐館、飯店、單位食堂等做煎炸食品后廢棄的煎炸用油。煎炸廢油屬于大分子疏水性有機物,其在多次煎炸過程中與空氣中的氧氣接觸,發(fā)生一系列水解、氧化、聚合等復(fù)雜反應(yīng),使得油黏度增加,油中原本含有的一些不飽和脂肪酸含量極低,產(chǎn)生了一些具有致癌作用的脂肪酸類聚合物及醛、酮、內(nèi)酯等刺激性氣味的物質(zhì)。泔水油主要是指從餐廚垃圾中分離回收的廢油,這類廢油是植物油和動物油的混合物,主要來自餐廚垃圾處理廠,容易收集和集中管理。地溝油是從餐飲單位廚房排水除油設(shè)施分離出的油脂和排水管道或檢查井清掏污物中提煉出的油脂,由于地溝油回收、加工及提煉過程衛(wèi)生條件惡劣,導(dǎo)致地溝油中含有多種有毒有害成分,重金屬、細菌、真菌、黃曲霉毒素等嚴(yán)重超標(biāo),因此地溝油對人體具有很大的危害性。餐廚廢油如果進入環(huán)境或被不法商販加工為食用油重新回到居民餐桌,會造成極大的環(huán)境污染,并嚴(yán)重威脅人類健康。同時餐廚廢油具有廢物與資源的二重性,由于其回收價格低,含碳量高,因此作為微生物培養(yǎng)的有效碳源獲得了廣泛的研究。

Taniguchi等研究發(fā)現(xiàn),Ralstonia eutropha(現(xiàn)重新命名為C.necator)能吸收植物油脂廢物以及廢動物脂,轉(zhuǎn)換成PHA,且產(chǎn)量較高,高達細胞干重的80%[29]。Stanislav Obruca等以廢棄菜籽油為底物,利用Cpriavidus necator H16生產(chǎn)PHA,通過連續(xù)培養(yǎng)PHA產(chǎn)量可達105g/L,每克油脂可產(chǎn)生0.83gPHA,產(chǎn)率為1.46gPHAL-1h-1[30]。Kahar等利用Ralstonia eutropha H16為實驗菌種,以廉價大豆油為碳源生產(chǎn)PHA,細胞干重可達118~126 g/L,PHA含量為 72%~76% (w/w)。研究表明,以廉價大豆油作為唯一碳源生產(chǎn)PHA,每克豆油可產(chǎn)生PHA0.72~0.76g,碳源成本降至0.4美元/kgPHA[31]。Pradella等利用大豆油為碳源,以Cupriavidus necator為出發(fā)菌種,研究表明當(dāng)大豆油添加量為40g/L時,細胞干重最高可達83g/L,PHB含量為81% (w/w),PHB 產(chǎn)率為2.5 gL-1h-1,且磷、銅、鈣、鐵等元素的缺乏會限制細菌的生長和PHB的合成[32]。Fernández等通過Pseudomonas aeruginosa 42A2利用廢的烹飪油和其他廢油生產(chǎn)PHA,該菌株可以積累54.6%的PHA[33]。孫萬東等用硫酸銨作氮源,以15g/L煎炸廢油為碳源生產(chǎn)PHB時,PHB的含量和產(chǎn)量分別為82.1%、10.86g/L,PHB的產(chǎn)率為0.724gL-1h-1,相同情況下利用煎炸廢油可以獲得比純豆油更高的PHB產(chǎn)量[21]。Verlinden等利用Cupriavidus necator 為實驗菌種,以煎炸廢油為底物生產(chǎn)PHA,PHA產(chǎn)量可達1.2g/L,與以葡萄糖為底物時濃度類似[34]。

5存在問題與展望

利用廢棄油脂生產(chǎn)PHA提供了廢棄油脂資源化途徑,但同時也存在一些問題。廢棄油脂組成較為復(fù)雜,且成分不穩(wěn)定,其中含有不能被微生物利用的成分,或許會影響微生物發(fā)酵合成 PHA。利用廢棄油脂生產(chǎn)的 PHA 分子量相對較小,且產(chǎn)品中容易存在油脂殘留。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,必將解決PHA生產(chǎn)成本較高的問題,同時提高產(chǎn)品質(zhì)量,并實現(xiàn)廢棄油脂的資源化利用和高附加值產(chǎn)品的開發(fā)。

[1] Rehm,BHA.Genetics and biochemistry of polyhydroxyalkanoate granule self-assembly:The key role ofpolyester synthases [J].Biotechnol Lett,2006,28(4):207~213.

[2] Lemoigne M.Products of dehydration and of polymerization of β-hydroxybutyric acid [J].Bull Soc Chem Biol,2009 8:770~782.

[3] Sudesh K,Abe H,Doi Y.Synthesis,structure and properties of polyhydroxyalkanoates:biological polyesters [J].Prog Polym Sci,2000,25(10):1503~55.

[4] Doudoroff M,Stanier R Y.Role of poly-beta-hydroxybutyric acid in the assimilation of organic carbon by bacteria [J].Nature,2010,183(4673):1440~1442.

[5] Wallen L L,Rohwedder W K.Poly-beta-hydroxyalkanoate from activated sludge [J].Environ Sci Technol,2012,8(6):576~579.

[6] Findlay RH,White DC.Polymeric beta-hydroxyalkanoates from environmental samples and Bacillus megaterium [J].Appl Environ Microbiol,2011,45(1):71~8.

[7] Smet M J,Eggink G,Witholt B,et al.Characterization of intracellular inclusions formed by Pseudomonas oleovorans during growth on octane [J].J Bacteriol,2011 154(2):870~878.

[8] Slater S C,Voige W H,Dennis D E.Cloning and expression in Escherichia coli of the Alcaligenes eutrophus H16 poly-β-hydroxybutyrate biosynthetic pathway [J].Bacteriol,2010,170(10):4431~4436.

[9] 甘智雄,莫曉燕,陳國強,等.嗜水氣單胞菌WQ 中PHBHHx 的合成及其分子基礎(chǔ)研究[J].微生物學(xué)報,2003,43(6):809~812.

[10] 盧曉云,吳瓊,張萬皎,等.嗜水氣單胞菌合成3-羥基戊酸單體的聚羥基脂肪酸共聚酯的研究[J].生物工程學(xué)報,2004,20(5):779~782.

[11] 胡風(fēng)慶,游松,陳國強.中長鏈聚羥基脂肪酸酯(mcl PHA)在嗜水氣單胞菌I型PHA合酶缺失突變株中的合成[J].生物工程學(xué)報,2005,21(4):524~529.

[12] 謝光健,李家洲.利用有機廢水生產(chǎn)聚羥基烷酸(PHAs)的進展[J].廣東化工,2005(7):34~36.

[13] 楊幼慧,伍朝暉,鐘士清,等.食品工廠活性污泥積累生物降解塑料PHA的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(8):5~8.

[14] 朱博超,焦寧寧.聚羥基脂肪酸酯的合成和應(yīng)用研究進展[J].現(xiàn)代塑料加工應(yīng)用,2003(05)

[15] 黃玉杰,王加寧,邱維忠,等.聚羥基脂肪酸酯的生物合成與廢棄物的資源化利用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(34):16751~16755.

[16] Lau N S,Chee J Y,Tsuge T,et al.Biosynthesis and mobilization of a novel polyhydroxyalkanoate containing 3-hydroxy-4-methylvalerate monomer produced by Burkholderia sp.USM(JCM15050) [J].Bioresource Technology,2010,101(20):7916~7923.

[17] Swift G.Opportunities for environmentally degradable polymers[J].Journal of Macromolecular Science,1995,32(4):641~651.

[18] Madison L L,Huisman G W.Metabolic engineering of poly-(3-hydroxyalkanoates):from DNA to plastic[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,1999,63(1):21~53.

[19] Angelo D P.Chiral chemistry is still evolving,driven by techniques and business demands[J].Genet Eng News,1996,6:19~25.

[20] 陳國強.生物高分子材料聚羥基脂肪酸酯(PHA)開發(fā)現(xiàn)狀及產(chǎn)業(yè)化前景分析[J].化工新型材料,2010,38(10):1~7.

[21] 孫萬東,張佑紅,耿安利,等.煎炸廢油生產(chǎn)聚羥基丁酸酯(PHB)[J].廣州化工,2013,41(12):114~117.

[22] Ashbv R D,Solaiman DKY,Foglia TA.Bacterial poly(hydroxyallianoate) polymer production from biodiesel co-product stream [J].J Polym Environ,2004,12(3):105~112.

[23] Mothes C,Schnorpfeil C,Ackermann J U.Production of PHB from crude glycerol [J].Eng Life Sci.,2007,7(5):475~479.

[24] Nikel P,Pettinari J,Mendez B.Poly(3-hydroxybutyrate) synthesis from glycerol by a recombinant Escherichia coli arcA mutant in fed-batch microaerobic cultures[J].Appl Microbiol Biotechnol,2008,77(6):1337~1343.

[25] Koller M,Bona R,Braunegg G,et la.Production of polyhydroxyalkanoates from agricultural waste and surplus materials [J].Biomacromolecules,2005(6):561~565.

[26] Cavalheiro JMBT,de Almeida MCMD,Grandfils C,et al.Poly(3-hydroxybutyrate) production by Cupriavidus necator using waste glycerol [J].Process Biochem,2009(44):509~545.

[27] Mazur L P,da Silva D D,Grigull V H,et al.Strategies of biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) supplemented with biodiesel obtained from rice bran oil [J].Materials Science and Engineering C,2009(29):583~587.

[28] 任連海.我國餐廚廢油的產(chǎn)生現(xiàn)狀、危害及資源化技術(shù)[J].北京工商大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011(6).

[29] Taniguchi I,Kagotani K,Kimura Y.Microbial production of poly(hydroxyalkanoate)s from waste edible oils [J].Green Chem,2003(5):545~548.

[30] Obruca S,Marova I,Snajdar O,Svoboda Z.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Cupriavidus necator from waste rapeseed oil using propanol as a precursor of 3-hydroxyvalerate[J].Biotechnology Letters,2010(32):1925~1932.

[31] Kahar P,Tsuge T,Taguchi K,Doi,Y.High yield production of polyhydroxyalkanoates from soybean oil by Ralstonia eutropha and its recombinant strain[J].Polymer Degradation and Stability,2004(83):79~86.

[32] Pradella,JGD,Ienczak JL,Delgado CR,Taciro MK.Carbon source pulsed feeding to attain high yield and high productivity in poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) production from soybean oil using Cupriavidus necator[J].Biotechnology Letters,2012(34):1003~1007.

[33] Fernandez D,Rodriguez E,Bassas M,et al.Agro-industrial oily wastes as substrates for PHA production by the new strain Pseudomonas aeruginosa NCIB 40045:effect of culture conditions[J].Biochem Eng J,2005,26(2/3):159~167.

[34] Verlinden R A,Hill D J,Kenward M A,et al.Production of polyhydroxyalkanoates from waste frying oil by Cupriavidus necator[J].AMB Express,2011(81):1~8.

通訊作者:任連海(1971—),男,河北人,副教授,主要從事固體廢棄物處理處置方面的教學(xué)研究工作。

作者簡介:劉慧(1990—),女,河北人,北京工商大學(xué)食品學(xué)院碩士研究生。

收稿日期:2014-12-04

中圖分類號:X703

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1674-9944(2015)01-0263-03