HLPC法測定感冒止咳顆粒中葛根素的含量

HLPC法測定感冒止咳顆粒中葛根素的含量

李媛，李強

(東營市食品藥品檢驗中心，山東 東營 257091)

摘要：目的采用高效液相色譜法測定感冒止咳顆粒中葛根素的含量。方法Agilent Eclipse XDB-C18柱 ( 4.6 mm×200 mm，5 μm)；以甲醇-水溶液(28∶72) 為流動相；檢測波長為250 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫：35 ℃。理論板數(shù)按葛根素峰計算應不低于4 000。 結果 葛根素與其相鄰雜質峰能完全分離，葛根素進樣量在0.088 22~0.441 1 μg 之間與峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)R2=1.000 0，平均加樣回收率為97.66%，RSD=0.8017%(n=6)。結論 本方法操作簡便，精密度好，結果準確可靠，可用于感冒止咳顆粒的質量控制。

關鍵詞：感冒止咳顆粒；葛根素；含量測定；高效液相色譜法

作者簡介：李媛，女，研究方向：中藥學，E-mail:licc22@163.com

中圖分類號：R927.2文獻標識碼：A

Determination of puerarin in Ganmao Zhike Granules by HPLC

LIYuan,LIQiang

(DongyingCenterforFoodandDrugControl,Dongying257091,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of puerarin in Ganmao Zhike Granules by HPLC.MethodsThe C18 column (4.6 mm× 200 mm，5 μm) was adopted with the mobile phase of methanol-water(28∶72)at the flow rate o f 1.0 mL·min-1，and the detection wavelength was 250 nm.Theoretical plate number should not be less than 4 000 according to the puerarin peak.ResultsThe date showed that this method could clearly separate puerarin peak from its nearby impurity peaks，with a better linear range of 0.008 82~ 0.441 1 μg(R2=1.000 0)，and the average recovery was 97.66% and the RSD was 0.801 7% (n=6).ConclusionThis method was simple，accurate and reliable，so it can be used for the quality control of Ganmao Zhike Granules.

Key words:Ganmao Zhike Granules;Puerarin;Determination;HPLC

感冒止咳顆粒處方來源于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》第二冊收載的感冒止咳沖劑(WB3-B-0446-90)，是由柴胡、金銀花、黃芩、連翹、葛根、青蒿、苦杏仁、桔梗、薄荷腦組成。輔料為蔗糖的中藥成方制劑。感冒止咳顆粒用于治療感冒發(fā)熱引起的頭痛、鼻塞、傷風、咳嗽、咽喉腫痛、四肢怠倦等癥。藥品中葛根用量較大，而葛根中主要含異黃酮成分葛根素、葛根素木糖苷等成分。其中的葛根素具有可有效逆轉化學誘導的肝纖維化，增強心肌收縮力，擴張血管、改善微循環(huán)，保護紅細胞的變形能力，增強造血系統(tǒng)功能，具有抗血小板聚集，增加纖溶活性，降低血粘度作用，對非特異性免疫、體液免疫、細胞免疫有明顯的調節(jié)作用，可促進正常人和腫瘤病人的淋巴細胞轉化率，增強自然素作用，對干擾系統(tǒng)有明顯的刺激和誘生作用[1~4,8]。

感冒止咳顆粒質量標準簡單，僅有連翹、葛根素、綠原酸鑒別項和黃芩苷的含量測定項[2]，因藥品中葛根藥效大、用量較大、文獻資料較少，故本實驗以葛根素為指標，采用高效液相色譜法測定含量，以控制感冒止咳顆粒的質量，以保證病人用藥的有效性。

1實驗部分

1.1儀器Agilent 1200 series 高效液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器；KQ-50B型超聲清洗器；Mettler Toledo電子天平。

1.2試藥葛根素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200912，供含量測定使用，以96.0%計)；甲醇為色譜純，水為去離子純化水，其余試劑為分析純；感冒止咳顆粒(生產廠家：太極特格爾，批號：13020005B、13020013B、13030002B、13030015B、13050007B；云南白藥，批號：ZAB1302、ZAB1309、ZAB1311、ZAB1333、ZAB1342；北京同仁堂，批號：2112006、2112017、2113011、2114004、2114016)。

2方法和結果

2.1色譜條件色譜柱：Eclipse-XDB-C18柱(4.6×200 mm，5 μm)；流動相:甲醇-水(28∶72)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長[5]：250 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。理論板數(shù)按葛根素峰計算應不低于4 000。

2.2對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12 h的葛根素對照品0.014 36 g，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取此貯備液2.00 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成濃度為44.11 μg·mL-1的對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備3種樣品，每種樣品5個批號，各取約10 g，研細。精密稱取約1 g，置于50 mL容量瓶中，精密加入甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，用甲醇定容到刻度，過濾，棄去初濾液，續(xù)濾液用孔徑0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4陰性樣品溶液的制備[6]按處方制備不含葛根素的陰性樣品，按“2.3”項下供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液。

2.5系統(tǒng)適應性試驗分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性樣品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液中葛根素能達到基線分離，樣品中其他成分對葛根素測定無干擾，理論板數(shù)按葛根素峰計算應不低于4 000，見圖1~3。

圖1　葛根素對照品HPLC色譜圖

圖2　感冒止咳顆粒HPLC色譜圖

圖3　感冒止咳顆粒陰性樣品HPLC色譜圖

2.6線性關系考察精密吸取“2.2”項下的對照品溶液2、4、6、8、10 μL分別注入高效液相色譜儀，測定峰面積積分值，以葛根素的進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程Y=3 940.2X-7.580 0，R2=1.000 0。結果表明，葛根素進樣量在范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.7精密度試驗精密吸取葛根素對照品溶液(44.11 μg·mL-1)5 μL,連續(xù)進樣5次，測定峰面積積分值，結果RSD=0.18%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.8穩(wěn)定性試驗精密吸取供試品溶液5 μL，在0～24 h內進樣6次(0、2、4、8、12、24 h),測定峰面積，以考察樣品溶液在檢測過程中待測成分的穩(wěn)定性。結果RSD為1.59%(n=6)，表明供試品在24 h內穩(wěn)定性良好，能夠滿足測定需要。

2.9重現(xiàn)性試驗取樣品(云南白藥集團股份有限公司，批號：ZAB1311)平行制備5份供試品溶液，按上述條件和方法進行測定，分別計算含量。結果葛根素的平均含量為2.502 mg·g-1，RSD為0.194 9%。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.10加樣回收率試驗精密稱取已知含量為2.435 mg·g-1的樣品(云南白藥集團股份有限公司生產)約0.5 g，共6份，加入濃度為44.11 μg·mL-1葛根素對照品溶液30 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，測定含量并計算回收率，結果葛根素平均回收率為97.66%，RSD為0.801 7%。

2.11樣品含量測定取3種感冒止咳顆粒樣品(太極特格爾、云南白藥、北京同仁堂)，分別按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，每個批號制備一個供試品溶液，在上述色譜條件下測定并計算葛根素含量，結果見表1。

表1　3種感冒止咳顆粒中葛根素含量測定結果

3討論

3.1提取溶劑的選擇[1,7]筆者比較了95%乙醇、50%乙醇和甲醇3種溶劑在超聲時間相同的情況下對樣品中葛根素的提取效果，發(fā)現(xiàn)以50%乙醇作為溶劑的提取效果稍好。但由于樣品中含有一定比例的蔗糖和糊精，因此經(jīng)50%乙醇超聲處理得到的供試品溶液含糖量高、粘度大，如果直接用于液相色譜測定，會嚴重損害色譜柱，且雜質峰較多；用甲醇提取能有效去除糖及其他雜質，且簡化操作步驟，故選用甲醇作為提取溶劑。

3.2提取時間的選擇分別對15、20、30、45 min不同提取時間進行考察。結果顯示15、20 min提取不完全，而提取30 min和60 min效果相當，故提取方法確定為超聲處理30 min。

3.3流動相的選擇[1,7]考察了不同溶劑系統(tǒng)[甲醇-0.3%磷酸溶液(25∶75)、甲醇-水(28∶72)、甲醇-水(25∶75)、甲醇-水(30∶70)]。最終結果表明以甲醇-水(28∶72)為流動相時，分離度及峰形較好。

3.4柱溫的選擇考察了HPLC法柱溫對葛根素分離度和峰形的影響，結果表明柱溫為35 ℃時，葛根素峰形和分離度最好。

4結論

4.1在進行藥物含量測定的探索性研究中，要嘗試采用不同的提取方法、提取溶劑、提取時間、流動相等多方面因素綜合分析，確定最佳的實驗方案。

4.2葛根素在甲醇中溶解，以甲醇超聲處理30 min進行提取試驗，測得含量最高。換做其他溶劑提取液中含有一定比例的蔗糖和糊精，對色譜柱損壞大。考察提取時間參照文獻并通過對不同提取時間的考察，以半小時為宜。

4.3本文測定方法簡便易行，結果準確，重現(xiàn)性好，可有效的控制感冒止咳顆粒的質量。

4.4通過測定3家不同廠家生產的各5批感冒止咳顆粒，含量存在一定的差別(太極特格爾：11.458 mg/袋；云南白藥：25.122 mg/袋；北京同仁堂：18.774 mg/袋),可能是因為不同廠家的生產工藝不同，并且葛根原料來源不同。根據(jù)《中國藥典》2010年版(一部)葛根中葛根素含量標準，按干燥品計算，含葛根素(C21H20O9)不得少于2.4%，故計算每袋藥品須含葛根素24 mg，根據(jù)檢測結果只有云南白藥集團股份有限公司生產的感冒止咳顆粒符合藥典標準。

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