板藍(lán)根乙酸乙酯部位體外抗病毒活性研究

·實(shí)驗(yàn)研究·

板藍(lán)根乙酸乙酯部位體外抗病毒活性研究

何立巍，楊婧妍，董偉，秦瑩亞

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046)

摘要：目的對(duì)板藍(lán)根的乙酸乙酯部位各化學(xué)組分進(jìn)行體外抗單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV1)活性研究。方法利用溶劑法和色譜法從板藍(lán)根中提取分離出20個(gè)乙酸乙酯組分，利用四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法檢測這20個(gè)組分體外對(duì)HSV1病毒的抑制作用,以細(xì)胞存活率、治療指數(shù)(TI)和細(xì)胞保護(hù)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較各化學(xué)組分的體外抗病毒的效果。結(jié)果 板藍(lán)根乙酸乙酯8個(gè)組分均有明顯的抗HSV1病毒作用，對(duì)病毒的抑制率均遠(yuǎn)大于50%。結(jié)論 板藍(lán)根乙酸乙酯部位中存在直接抗病毒較強(qiáng)的活性成分，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，將有助于闡明板藍(lán)根抗病毒藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：板藍(lán)根；乙酸乙酯部位；抗病毒；四甲基偶氮唑鹽比色法

基金項(xiàng)目：國家自然基金資助項(xiàng)目(No.81073023,No.81073023)；國家教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(No.20093237120015)

作者簡介：何立巍，男，副教授，研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥及天然藥物活性成分及物質(zhì)基礎(chǔ)研究，E-mail:he_lw@163.com

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Study on antiviral activity ofRadixIsatidisethyl acetate extract in vitro

HELi-wei,YANGJing-yan,DONGWei,QINYing-ya

(CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210046,China)

Abstract：ObjectiveTo research the antiviral activity against herpes simplex virus type Ⅰ (HSV1) activity of each chemical component of Radix Isatidis extracted with ethyl acetate in vitro.MethodsExtracting and separating 20 components from Radix Isatidis in ethyl acetate using solvent and chromatography methods.Detecting this 20 components inhibition to HSV1 virus in vitro using MTT assay，with cell viability，therapeutic index (TI) and cell protection rate as evaluation indexes,and comparing the antiviral activities of each component in vitro.ResultsEight components of Radix Isatidis had significant anti-viral effect of HSV-1.Inhibition rate to the virus was much greater than 50%.ConclusionThere were strong antiviral of active ingredients in Radix Isatidis.In-depth study of its structure would help to clarify the material basis of antiviral effect of Radix Isatidis.

Key words:RadixIsatidis；Ethyl acetate extract;Antiviral;MTT method

板藍(lán)根是十字花科植物菘藍(lán)IsatisindigoticaFort.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽之功效。藥理研究證實(shí)，板藍(lán)根提取液對(duì)流感病毒、乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、柯薩奇病毒、腎綜合征出血熱病毒、巨細(xì)胞病毒等均有顯著的抑制作用。故臨床上廣泛用于抗病毒、抗菌，并具有抗腫瘤，增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能，抗內(nèi)毒素作用[1～4]。為了明確板藍(lán)根抗病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，指導(dǎo)其活性成分的分離和純化，本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法和 MTT 法[5]對(duì)板藍(lán)根乙酸乙酯部位的抗病毒活性進(jìn)行了篩選。

1儀器與材料

1.1實(shí)驗(yàn)儀器96孔板(美國Corning公司);Power Wave 340型酶標(biāo)儀(美國Bio-Teck公司);BC- J80S型CO2培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司);CKX31SF型顯微鏡(Olympus);SW-CT-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);79-1型磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇醫(yī)療儀器廠);SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器(易普易達(dá));LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)病毒與細(xì)胞株人類單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)傳代2次，以提高病毒毒力，由南京醫(yī)科大學(xué)病毒所提供；非洲綠猴腎(vero)細(xì)胞(為HSV型病毒敏感細(xì)胞，由南京醫(yī)科大學(xué)病毒所提供)，常規(guī)培養(yǎng)于含10%FCS的 RPMI 1640生長液中，內(nèi)含青霉素0.06 mg·mL-1，鏈霉素0.1 mg·mL-1，NaHCO32 mg·mL-1，37 ℃培養(yǎng)生長成單層，待用。

1.3實(shí)驗(yàn)藥品與試劑板藍(lán)根藥材以95%乙醇10倍量、8倍量提取2次，合并提取液，減壓濃縮乙醇至無醇味，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯部位12.6 g；取乙酸乙酯部位以硅膠吸附柱色譜進(jìn)行分離，以石油醚-乙酸乙酯(100∶1~100∶50梯度洗脫)，收集各流分，薄層色譜檢查，相同化學(xué)成分流份合并，得乙酸乙酯各化學(xué)組分1~20；各樣品用DMSO(二甲基亞砜)溶解，至濃度為200 mg·mL-1，作為供試樣品母液。

10%新生小牛血清(中美合資蘭州民海生物工程有限公司，批號(hào)：20050629)， RPMI 1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)， 100TCID50 病毒液(病毒傳代培養(yǎng)后由南京中醫(yī)藥大學(xué)微生物與免疫教研室配制)。其余化學(xué)試劑如石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純。

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代非洲綠猴腎(vero)細(xì)胞為貼壁生長型細(xì)胞，常規(guī)復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)。Vero細(xì)胞在100 mL·L-1胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,含50 mL·L-1二氧化碳，37 ℃，濕度95%培養(yǎng)箱內(nèi)密閉單層培養(yǎng)。

2.2藥物無毒界限的測定取生長良好的vero細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后,加含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基,制備細(xì)胞數(shù)為2×105·mL-1的懸浮液，加至96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，0.1 mL/孔，37 ℃ 5%CO2溫育24 h細(xì)胞長成單層，吸棄單層細(xì)胞上的培養(yǎng)液。將樣品溶液分別稀釋為10個(gè)濃度液體,分別為：2 000、1 000、500、200、100、40、20、8、4、0.8 μg·mL-1。分別加入各細(xì)胞孔中,每孔加入0.2 mL，每一稀釋度設(shè)立4孔，同時(shí)設(shè)立2個(gè)細(xì)胞對(duì)照組。37 ℃ 5%CO2溫育72 h后每孔加入MTT 20 μL,再放入37 ℃ 5%CO2溫育培養(yǎng)箱4 h后，吸棄上清液，每孔加二甲基亞砜(DMSO)200 μL，振蕩5～10 min，使顆粒溶解，用酶標(biāo)免疫檢測儀測490 nm處吸光度(OD)的值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)孔OD值/細(xì)胞對(duì)照孔OD值。無明顯細(xì)胞毒性(存活率大于80%)表現(xiàn)的濃度即為藥液的無毒界限[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藥物的無毒最高濃度如表1。

表1　細(xì)胞毒性測定(存活率法)

2．3抗病毒活性篩選取生長良好的vero細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后,加含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，制備細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞加入96孔板制成單層(約4×104/孔)，0.1 mL/孔，37 ℃ 5%CO2溫育24 h細(xì)胞長成單層，吸棄單層細(xì)胞上的培養(yǎng)液。加入40 μL/孔的病毒液，細(xì)胞組加入40 μL/孔的PBS液，放入CO2孵育箱1 h，使病毒吸附于細(xì)胞上。將藥液以無毒界限為最高濃度作4個(gè)稀釋度(如表1)分別加入細(xì)胞孔中,每一稀釋度設(shè)3孔,同時(shí)設(shè)立病毒對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組，37 ℃ 5%CO2作用72 h,接著加入MTT，每孔20 μL，37 ℃ 5%CO2作用4 h后棄上清加入DMSO,每孔200 μL，振蕩5～10 min,待結(jié)晶完全溶解用酶標(biāo)免疫檢測儀測490 nm處OD值,計(jì)算細(xì)胞保護(hù)率。

細(xì)胞保護(hù)率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-病毒對(duì)照孔OD值)/(細(xì)胞對(duì)照孔OD值-病毒對(duì)照孔OD值)。

病毒感染細(xì)胞3天后，MTT法測細(xì)胞保護(hù)率，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增高細(xì)胞保護(hù)率增高。最大保護(hù)率大于50%的藥物為1、9、13、14、15、16、17、19號(hào)，最大保護(hù)率大于30%、小于50%的藥物為4、5、8號(hào)，結(jié)果詳見表2。

按Reed-Muench方法計(jì)算半數(shù)毒性濃度(TC50)[2]。TC50=lg-1[lgCm-I(P總-0.5)]；其中Cm表示最大濃度，I表示lg(Cm/與Cm相臨的濃度)，P總表示所有濃度的總抑制率，結(jié)果見表3。

表2　各組分對(duì) HSV-1 感染的保護(hù)作用(MTT法)

表3　各組分的半數(shù)毒性濃度(TC 50)

按Reed-Muench方法計(jì)算細(xì)胞存活率、藥物半數(shù)抑制病毒濃度(IC50),lgIC50=lgCm-I[P總-(3-Pm-Pn)/4]；以治療指數(shù)(TI)評(píng)價(jià)藥物抗HSV1的效果,其中TI=TC50/IC50，結(jié)果見表4。

表4　各組分的半數(shù)抑制病毒濃度(IC 50)

3討論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)板藍(lán)根乙酸乙酯化學(xué)部位，通過柱色譜的方法作了進(jìn)一步的分離，得到化學(xué)成分較為集中的各化學(xué)組分(單體或幾個(gè)單體的活混合物)，在對(duì)其抗病毒活性篩選研究組中發(fā)現(xiàn)，9、16、17、19號(hào)組分的抗病毒作用最強(qiáng)，且治療窗較小，可能為直接抗病毒作用，對(duì)這些組分做進(jìn)一步結(jié)構(gòu)方面的研究，將有可能發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根新的抗病毒活性成分，并進(jìn)一步闡明板藍(lán)根抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)。

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