db—cAMP和卵丘細胞單層對豬卵母細胞體外成熟及孤雌胚胎發(fā)育潛力研究

徐國旗　華再東　張立蘋　肖紅衛(wèi)　劉西梅　許生成　鄭新民

摘要：為提高卵母細胞體外成熟及孤雌胚胎發(fā)育的能力，探討了雙丁酰基腺苷酸環(huán)化酶（db-cAMP）和卵丘細胞單層共培養(yǎng)對豬卵母細胞體外成熟及孤雌胚胎體外發(fā)育潛力。結(jié)果表明，成熟培養(yǎng)液中分別添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-cAMP時，卵母細胞的體外成熟率依次降低，但濃度為1 mmol/L時的孤雌胚囊胚率（27.03%）顯著高于其他各組（P<0.05）；卵丘細胞單層共培養(yǎng)卵母細胞時，其成熟率、卵裂率及囊胚率（86.00%、89.04%、28.36%）也得到了顯著提高；0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘細胞單層共培養(yǎng)時，其成熟率和卵裂率（85.78%和88.95%）與對照組差異不顯著，但囊胚率（35.14%）顯著提高。0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘細胞單層共培養(yǎng)能夠顯著提高豬卵母細胞的體外成熟及孤雌胚胎的發(fā)育潛力。

關(guān)鍵詞：db-cAMP；卵丘細胞單層；體外發(fā)育；豬

中圖分類號：S828 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）24-6303-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.053

Abstract： To improve the developmental potential of pig oocytes in vitro maturation and parthenogenetic embryos， the effects of db-cAMP concentration and cumulus cells monolayer on in vitro maturation and parthenogenetic potential of pig oocytes was investigated. The tests indicated that as the concentration of db-cAMP increased （0、0.5、1.0、1.5 and 2.0 mmol/L）， the maturation rate of oocytes reduced successively. But the blastocyst rate of 1 mmol/L group（27.03%） was significant higher than others（P<0.05）； When oocytes were co-cultured with pig cumulus cell monolayer， the maturation rate、cleavage rate and blastocyst rate（86.00%、 89.04%、 28.36%） were significantly improved. 0.4 mmol/L db-cAMP co-cultured with the monolayer cumulus cell had no significant difference in maturation rate and cleavage rate（85.78% and 88.95%）， but the blastocyst rate（35.14%） were significantly improved. 0.4 mmol/L db-cAMP co-cultured with monolayer cumulus cell can improve the development of parthenogenetic embryos.

Key words：db-cAMP；cumulus cell monolayer；in vitro development；pig

隨著胚胎生物技術(shù)的發(fā)展，豬卵母細胞體外成熟及發(fā)育能力已成為體外受精（IVF）、胞漿單精子注射（ICSI）和核移植（NT）等技術(shù)成功的關(guān)鍵[1]。然而，目前豬卵母細胞體外成熟系統(tǒng)并不完善，體外成熟培養(yǎng)時間較長，許多理化因素直接或間接地影響著卵母細胞的體外成熟及后期發(fā)育。研究表明，豬的卵母細胞核在38 h就完成了核的成熟，而胞質(zhì)的成熟則要到42 h左右才能完成，核質(zhì)成熟的不同步可能是影響豬卵母細胞體外發(fā)育的主要因素[2]。部分卵母細胞在體外培養(yǎng)過程中能自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂從而使細胞核成熟，但是細胞質(zhì)的成熟往往要滯后于核的成熟而導(dǎo)致卵母細胞成熟質(zhì)量差，最終影響后期胚胎的發(fā)育[3]。因此，提高卵母細胞的體外成熟質(zhì)量，使其卵母細胞核、質(zhì)同步成熟，獲得較強的發(fā)育能力，是提高體外胚胎生產(chǎn)效率的一個重要環(huán)節(jié)[4，5]。

腺苷酸環(huán)化酶（cAMP）是一種主要由卵丘細胞分泌產(chǎn)生的核成熟抑制因子，可通過與卵細胞間隙連接相互影響，從而維持cAMP的水平，提高卵母細胞的發(fā)育能力[6，7]。cAMP的水平在哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂阻滯和恢復(fù)中起著決定性作用，高水平的cAMP能夠阻滯卵母細胞生發(fā)泡破裂（Germinal vesicle breakdown， GVBD），只有當卵母細胞內(nèi)cAMP的水平下降到一定程度時才能啟動卵母細胞的減數(shù)分裂[8]。雙丁酰基腺苷酸環(huán)化酶（db-cAMP）是cAMP類似物，在體外成熟過程中同樣能夠阻滯卵母細胞減數(shù)分裂進程，在成熟培養(yǎng)液中添加適量db-cAMP，適當延緩細胞核的成熟，達到核質(zhì)成熟同步，從而可在一定程度上提高卵母細胞的質(zhì)量[9]。然而，豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)時對db-cAMP的劑量依賴性較大，其最佳添加濃度還有待進一步研究。此外，卵丘細胞不僅能夠產(chǎn)生大量的cAMP，并且在卵母細胞生長發(fā)育、體外受精、胚胎發(fā)育等過程中都起著重要作用[10]。目前卵丘細胞對卵母細胞體外成熟影響的研究主要集中在卵丘細胞層數(shù)方面[11]。本試驗以屠宰場采集的豬卵母細胞為研究對象，在db-cAMP、卵丘細胞單層及其共培養(yǎng)時，研究了卵母細胞體外成熟及其后期胚胎發(fā)育能力的影響，為優(yōu)化卵母細胞體外成熟體系提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

除特別標識外，所有化學試劑均購自Sigma公司（St. Louse，MO，USA）；洗卵液（DPBS）以及TCM-199購自Gibco公司；孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）由寧波激素制品廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 豬卵母細胞的采集和體外成熟培養(yǎng) 從當?shù)赝涝讏霾杉迈r卵巢，放入30～37 ℃含青、鏈霉素的生理鹽水中，1.5 h內(nèi)運回實驗室。用生理鹽水（37 ℃）沖洗干凈后置于37 ℃水浴鍋中。用配有16號針頭的10 mL注射器抽吸直徑為3～6 mm的卵泡，收集卵泡液于50 mL的離心管中，靜置10～20 min后，從底部沉淀物中撿取卵丘包裹3層以上的卵丘卵母細胞復(fù)合體（COCs），經(jīng)添加PVA的DPBS洗滌3遍，再用CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡2 h以上的豬卵母細胞成熟培養(yǎng)液（TCM-199+3.05 mmol/L葡萄糖+0.91 mmol/L丙酮酸鈉+1 mmol/L L-谷氨酰胺+0.57 mmol/L L-半胱氨酸+10%pFF +10 IU/mL hCG+10 IU/mL PMSG+75 μg/mL青霉素+ 50 μg/mL硫酸鏈霉素）洗滌3遍。將洗好的COCs放在39 ℃、100%濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（20±2） h，隨后轉(zhuǎn)移到無hCG和PMSG的成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)（20±2） h。將擴散良好的卵母細胞用0.1%的透明質(zhì)酸酶反復(fù)吹打數(shù)次脫去顆粒細胞，再用DPBS洗卵液清洗2～3次，挑選卵母細胞胞質(zhì)濃稠、卵周間隙明顯、排出第Ⅰ極體的卵母細胞備用。

1.2.2 豬卵丘細胞單層的制備 取COCs用0.1%透明質(zhì)酸酶脫去周圍的卵丘細胞，去除機械裸卵（DOs） 后將剩下的液體置于1.5 mL離心管中，靜置數(shù)分鐘后吸取中上層液體離心，經(jīng)成熟培養(yǎng)液洗3次后，轉(zhuǎn)移至24孔板（0.5×106～1×106個/孔）中，置于39 ℃、5% CO2、濕度100%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞長成卵丘顆粒細胞單層時備用。

1.2.3 孤雌激活 將成熟后脫去卵球的卵母細胞用融合/激活液（0.25 mol/L甘露醇+0.5 mmol/L 氯化鈣+0.5 mmol/L 硫酸鎂+0.5 mmol/L HEPES+0.01% PVA）洗滌3次，分批放入已經(jīng)鋪滿融合液，電極寬度為1 mm的融合槽（BTX ECM2001電融合儀配套電激活槽）中，用ECM2001（BTX，USA）融合儀施加一個30 μs，1.3 kv/cm的1次直流電脈沖激活，再用添加4 mg/mL BSA的NCSU-23洗滌3～5次，隨后轉(zhuǎn)入礦物油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液（NCSU-23）中，在39 ℃、5% CO2、濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察并記錄卵裂情況，7～8 d后觀察記錄囊胚發(fā)育情況。

1.2.4 db-cAMP對卵母細胞成熟及孤雌胚胎體外發(fā)育的影響 用添加不同濃度db-cAMP（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L）的成熟培養(yǎng)基體外成熟培養(yǎng)22 h后轉(zhuǎn)入無激素及db-cAMP的成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)22 h，統(tǒng)計第Ⅰ極體排出率，并進行孤雌激活，觀察記錄早期胚胎發(fā)育情況。

1.2.5 卵丘細胞單層共培養(yǎng)對卵母細胞成熟及孤雌胚胎體外發(fā)育能力的影響 試驗分為4組：①對照組（COCs單獨培養(yǎng)）；②COCs+卵丘細胞單層；③機械裸卵（Dos）+卵丘細胞單層；④Dos單獨培養(yǎng)。44 h后統(tǒng)計第Ⅰ極體排出率，并進行孤雌激活，觀察記錄早期胚胎發(fā)育情況。機械裸卵（Dos）是將成熟培養(yǎng)前選取的COCs用0.1%透明質(zhì)酸酶脫除包裹在其周圍的卵丘細胞得到。

1.2.6 db-cAMP與卵丘細胞共培養(yǎng)對卵母細胞成熟及孤雌胚胎體外發(fā)育潛力的影響 選取最適濃度的db-cAMP添加到成熟培養(yǎng)基與卵丘細胞單層共培養(yǎng)22 h，隨后轉(zhuǎn)入到無激素及db-cAMP的成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)22 h，統(tǒng)計第Ⅰ極體排出率，并進行孤雌激活，隨后觀察記錄早期胚胎發(fā)育情況。

1.3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用卡方方法進行分析檢驗，P<0.05為差異顯著，每個試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 COCs細胞及胚胎發(fā)育情況

撿取卵丘包裹3層以上的卵丘卵母細胞復(fù)合體（COCs）（圖1A）進行體外培養(yǎng)44 h。挑選卵母細胞胞質(zhì)濃稠、卵周間隙明顯、排出第Ⅰ極體的卵母細胞激活，激活后的卵母細胞如圖1B所示。然后在39 ℃、5% CO2、濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察并記錄卵裂情況如圖1C所示；7～8 d后觀察記錄囊胚發(fā)育情況如圖1D所示。

2.2 不同db-cAMP濃度對卵母細胞體外成熟的影響

卵母細胞在添加了不同濃度db-cAMP的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)22 h后，轉(zhuǎn)入不含db-cAMP和激素的成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)22 h。結(jié)果表明，豬卵母細胞成熟率隨著db-cAMP濃度增加呈降低趨勢。與對照組（71.37%）相比，濃度為0.5、1.0 mmol/L時的成熟率（69.57%和67.15%）差異不顯著 （P >0.05）（表1），而濃度為1.5、2.0 mmol/L時（49.56%和34.30%）顯著降低（P<0.05）。

孤雌激活后觀察卵裂及囊胚發(fā)育情況，1 mmol/L組的卵裂率顯著高于2 mmol/L和3 mmol/L組（P<0.05），而與對照組及0.5 mmol/L組間差異不顯著（P>0.05），但其囊胚率顯著高于其他各組（P<0.05）（表1）。

2.3 卵丘細胞對卵母細胞體外成熟的影響

由表2可以看出，在以卵丘細胞單層為飼養(yǎng)層的情況下，COCs經(jīng)44 h成熟培養(yǎng)后成熟率、卵裂率、囊胚率均顯著高于其他各組（P<0.05）。與對照組相比，機械裸卵在有或無卵丘細胞單層時的成熟率、卵裂率、囊胚率都顯著降低（P<0.05），但卵丘細胞單層能顯著提高機械裸卵的成熟率及后期胚胎發(fā)育能力（P<0.05）。

2.4 db-cAMP與卵丘細胞單層共培養(yǎng)對卵母細胞體外成熟的影響

選取1 mmol/L的db-cAMP為最適添加濃度，與卵丘細胞單層共培養(yǎng)，結(jié)果（表3）表明，當在共培養(yǎng)組中添加db-cAMP時卵母細胞的體外成熟率、卵裂率以及囊胚率（62.79%、71.96%和18.38%）都顯著降低（P<0.05）。濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L db-cAMP與卵丘細胞單層共培養(yǎng)，卵母細胞體外成熟率隨濃度增加呈遞減趨勢，但0.4 mmol/L db-cAMP與卵丘細胞單層共培養(yǎng)時，囊胚率最高（35.14%）。

3 小結(jié)與討論

核質(zhì)成熟不同步往往是影響卵母細胞體外成熟質(zhì)量的主要因素，而卵母細胞內(nèi)高水平cAMP可阻滯減數(shù)分裂的恢復(fù)，在一定程度上抑制核的成熟，從而達到核質(zhì)成熟的同步化[9]。本試驗通過添加一定劑量的核成熟抑制因子類似物db-cAMP來延遲核的成熟，力求達到核質(zhì)同步成熟，提高體外胚胎質(zhì)量。結(jié)果表明，db-cAMP對卵母細胞核成熟的抑制作用具有明顯的劑量依賴性。隨著劑量的增加，卵母細胞的成熟率呈現(xiàn)遞減趨勢，然而添加劑量為0.5和1.0 mmol/L時，成熟率的降低并不影響后續(xù)胚胎發(fā)育的卵裂率及囊胚率，添加1.0 mmol/L的db-cAMP能顯著提高孤雌胚胎的后期發(fā)育能力。這與Zhao等[12]關(guān)于體外添加db-cAMP能顯著提高囊胚率的報道一致。

研究表明，卵丘-卵母細胞復(fù)合體（COCs）中cAMP主要來源于卵丘細胞，并通過與卵母細胞間的間隙連接運輸?shù)桨|(zhì)中[7]，因此COCs中總的cAMP水平在一定程度上取決于卵丘細胞的數(shù)量。此外，卵丘細胞能將卵泡液中的胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼幔兄诼涯讣毎麑Π腚装彼岬墨@取，從而促進卵母細胞的胞質(zhì)成熟[13]。如果兩者間縫隙連接被過早破壞 ，卵母細胞可能停止發(fā)育[14]。本試驗結(jié)果表明，COCs與卵丘細胞單層共培養(yǎng)能顯著提高卵母細胞成熟率及后期胚胎發(fā)育能力。將脫去卵丘后的機械裸卵與卵丘細胞單層共培養(yǎng)時能夠極大地提高其體外成熟能力，這可能是由于裸卵不能直接利用葡萄糖，而卵丘細胞能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為丙酮酸而被裸卵利用，從而為卵母細胞的生長和發(fā)育提供能量。此外，裸卵緊貼于卵丘細胞上，可能與卵丘細胞形成正常的間隙鏈接，或通過旁分泌，產(chǎn)生一些促卵細胞成熟因子，提高卵母細胞的成熟率及胚胎質(zhì)量[15]。

本研究中，筆者設(shè)想通過添加適量的db-cAMP與卵丘細胞單層共培養(yǎng)來提高卵母細胞質(zhì)量，然而結(jié)果表明，當卵母細胞在添加1 mmol/L db-cAMP的成熟培養(yǎng)液中與卵丘細胞單層共培養(yǎng)時，成熟率及卵裂率都大大降低。這可能是卵丘細胞單層產(chǎn)生了足夠的cAMP，調(diào)節(jié)核質(zhì)的成熟，再加入其類似物，其含量總和超過了最適抑制濃度，因而阻滯了卵母細胞的正常成熟。選取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L db-cAMP幾個濃度與卵丘細胞單層共培養(yǎng)，結(jié)果表明，0.4 mmol/L db-cAMP與卵丘細胞單層共培養(yǎng)時，囊胚率得到了顯著性提高。

綜上所述，cAMP對卵母細胞的體外成熟和胚胎早期發(fā)育影響重大，1 mmol/L db-cAMP或0.4 mmol/L db-cAMP與卵丘細胞單層共培養(yǎng)時，能夠較好地調(diào)節(jié)卵母細胞核質(zhì)的同步成熟，從而在一定程度上提高孤雌胚胎早期發(fā)育能力。然而，0.4 mmol/L db-cAMP與卵丘細胞單層共培養(yǎng)時的囊胚率顯著高于其他各組，這可能是由于卵丘細胞能夠產(chǎn)生某些其他因子，從而促進了卵母細胞的胞質(zhì)成熟，有助于核質(zhì)成熟同步化，其相關(guān)機制有待進一步研究驗證。

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