用于激光共聚焦顯微鏡的光譜掃描機構

用于激光共聚焦顯微鏡的光譜掃描機構

朱磊1，2*張運海1，2

(1.中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所 醫用光學室，蘇州 215163；2.江蘇省醫用光學重點實驗室, 蘇州 215163)

摘要：隨著生物醫學技術的發展，組織樣本經常被多種熒光標記物標記，需要通過光譜成像的方法區分出樣本中不同的成分。本文在共聚焦顯微鏡基礎上，介紹了一種由精密絲杠和步進電機控制的狹縫機構實現光譜成像的方法，討論了狹縫縫片的具體設計和狹縫運動精度對光譜帶寬和波長準確度的影響。

關鍵詞：共聚焦顯微鏡；光譜成像；狹縫

作者簡介：朱磊，男，1979出生，工程師，主要從事激光共聚焦顯微鏡成像技術方面的研究，E-mail：freewind2000@163.com。

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2015.01.012

收稿日期：2014-06-06

A spectral scanning mechanism for laser scanning confocal microscopy.ZhuLei1,2*,ZhangYunhai1 2(1.SuzhouInstituteofBiomedicalEngineeringandTechnology,ChineseAcademyofSciences,Suzhou215163,China;2.JiangsuKeyLab.ofMedicalOptics,Suzhou215163,China)

Abstract:This paper introduces a slit mechanism controlled by two precision lead screw and stepper motor, and discusses the accuracy of the spectral bandwidth which is affected by the slit kinematics.

Key words：laser scanning confocal microscopy;spectral imaging;slit

1概述

激光掃描共焦顯微鏡[1,2](Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)是研究亞微米細微結構的有效技術手段。不同于一般的熒光顯微成像，共焦顯微鏡在光路中加入與物點共軛的探測針孔，起到空間濾波作用，能夠去除離焦熒光的干擾，獲得高信噪比的圖像；共聚焦顯微鏡通過逐點逐層的掃描方式，可以實現對觀測樣品區域的三維成像。激光掃描共焦顯微鏡在組織生物學、細胞生物學、分子生物學、基因學、胚胎學、神經學、病理學、免疫學、流行病學、腫瘤學、細菌學、病毒學等生物和醫學領域有廣闊的應用。

使用熒光光譜儀對多熒光標記樣品產生的熒光，進行光譜分光并探測，需要滿足較高的熒光光譜分辨率。由于共聚焦中熒光信號自身就很低，經過光譜分光后的信號則變得更為弱小，因此光譜儀的效率尤為重要。

共聚焦激光顯微鏡中完成光譜成像首先要對探測的熒光進行光譜分光，光譜分光主要基于兩種方式，分別是棱鏡分光和光柵分光。在光柵分光中因為對分光元件的旋轉精度要求高，機構大都結構復雜，成本較高，不予采用。本文討論的光譜掃描技術是基于棱鏡分光基礎上，通過控制可移動狹縫的直線運動設定狹縫寬度及中心位置[3]，移動狹縫實現光譜掃描，完全滿足共聚焦的光譜帶寬和波長精度要求[4]，結構精簡實用，成本較低，同時也能滿足在共聚焦顯微鏡中光譜掃描成像功能的要求。

2激光掃描共聚焦顯微鏡光譜成像系統的構成

激光掃描共聚焦顯微鏡光譜成像系統示意圖如圖1所示，由分光模塊、狹縫掃描機構、熒光探測模塊構成。

共聚焦成像部分采用經典的技術方案[5]，本文不予詳述。下面簡單介紹在共聚焦顯微鏡技術基礎上實現光譜成像技術方法，激光光源發出的準直激光經共聚焦光路后在組織樣本處聚焦，組織樣本中的熒光物質被激光激發后沿相同的光路返回。返回的熒光通過針孔透鏡聚焦針孔，如圖1所示，再從針孔出射后經準直透鏡進入分光棱鏡，分光棱鏡將熒光光譜展開后再經聚焦透鏡聚焦，形成一條光譜帶，在光譜帶位置處設置有兩個可以獨立移動的縫片，兩個縫片之間形成一個出射狹縫，狹縫的寬度和狹縫相對于光譜帶的位置可以根據需要進行設置，透過狹縫后的熒光成分進入到PMT(光電倍增管)，PMT將光信號轉換為電流信號，對其進行電信號采樣同時記錄下掃描單元的位置坐標，進行圖像重建就可以生成一幅二維共聚焦圖像[6]。

根據設計需求，本系統技術指標如下：工作波長范圍為400～700nm。最小光譜帶寬為5nm。

圖1　光譜成像系統示意圖

3光譜分光方案

光譜分光常采用棱鏡分光或光柵分光，光柵分光方法光能利用率低，而共聚焦顯微成像中，熒光較弱，此外經過光譜分光后，由于熒光被光譜展寬，成像時只取光譜條帶中的一部分熒光能量進行成像，有效使用的熒光很微弱，基于此，本研究擬采用光能利用率相對較高的棱鏡分光方案。

對于基于棱鏡的分光方式，是利用棱鏡材料對不同波長的光有不同的折射率這一性質來實現的。由折射定律和幾何關系可知，當棱鏡工作在最小偏向角情況時，棱鏡的角色散為

(1)

A為棱鏡頂角，dn/dλ為棱鏡的物質色散，n為棱鏡材料的折射率。材料的折射率與波長的關系可由Cauchy公式、Schott公式、Sellmeier公式等得到。

(2)

由于不同波長出射光線的偏向角dδ是非線性，這就導致不同波長出射光線在光譜像面上對中心波長 λ的位移也是非線性的，表1給出了不同波長時光譜儀的線色散數及狹縫掃描位移距離的數據。

表1　不同波長狹縫移動量

對棱鏡來說，很重要的一個特點是僅具有一個光譜條帶，這就使得它不存在光譜級次之間的重疊，其自由光譜范圍也不受限制，并且入射光能量得到充分的利用，光能透過效率整體較高，探測的靈敏度高。但是它的色散是非線性的。

分光棱鏡的可選材料多種多樣，應當按照儀器實際要求進行篩選。本系統初始條件要求譜面不大于6mm，則整個光譜范圍的平均線色散倒數dλ/dl不大于50nm/mm，狹縫最小寬度50μm對應的極限分辨率為5nm，則要求任意波長下的線色散倒數dλ/dl不大于125nm/mm。

ZF4的線色散倒數為7.7～72.4nm/mm，F4線色散倒數為16.4～118.6nm/mm，(如圖2所示)符合初始條件對線色散倒數的要求，其余材料在部分波段線色散倒數大于125nm/mm，分辨極限達不到要求，重火石玻璃色散能力強，但在藍、紫波段吸收強，透過率很低，相比而言，火石玻璃更適合。在400～700nm范圍內，譜面上的線色散倒數為整個譜面長度為6.87mm，超過初始條件要求，篩選火石玻璃中其余牌號并計算各材料對應的譜面大小，結果如表2。

表2　各牌號火石玻璃對應的譜面長度

圖2　相同布局下多種材料線色散倒數

可以看出，所有材料的色散譜面均超過要求。受探測器件本身外形尺寸的限制，當探測器直接接收經過狹縫后的熒光信號，只有在譜面非常狹窄時，感光面才可覆蓋最大譜面(400～700nm范圍)，此時，極限分辨率已大大超過5nm，且對機構的運動精度要求提高。本系統在現有情況下，加裝了焦距100mm的聚焦鏡(圖1)實現收集整個譜面信號的效果，因此對譜面大小的要求可根據實際情況適當放寬，現有幾種火石玻璃均可滿足要求。

下面以F4為例，分析棱鏡的非線性色散在不同波段對于光譜參數和狹縫位移精度的要求。表3為不同波長下波長間隔50nm對應的譜面大小，不同波長處狹縫移動的要求見表4。

表3　不同波段50nm譜寬對應的實際譜面長度

表4　不同起始波長下模塊的光譜性能與對狹縫移動量的要求

續表4

由表4可見，本模塊的極限分辨率達到要求，當帶寬改變3nm時對應的最小狹縫位移量為25.4μm，因此且當狹縫機構運動精度達到在10μm 時，對應的光譜帶寬的選擇精度達到了1nm。

4狹縫機構設計

4.1　整體機構

在狹縫的技術指標方面，確定出射狹縫寬度最小50μm，調節范圍0.05～6.7mm，縫片調節增量10μm。根據以上需求，設計出如圖3所示的狹縫結構：狹縫固定座兩端分別固定步進電機，電機帶動狹縫滑塊運動，左右狹縫固定在兩個狹縫運動滑塊上，狹縫運動座兩端裝有位置傳感器標定狹縫初始位置，中間防碰撞傳感器防止狹縫運動時發生碰撞。工作時，狹縫初始化，左右狹縫分別觸發兩側的位置傳感器，狹縫縫片復零位。控制系統根據設計確定的特定譜帶或波段488nm的位置，驅動兩側電機運動，將左右狹縫精確運動至所需的對應距離。

圖3　移動式狹縫機構 1.左縫片驅動電機 2.狹縫固定座 3.左絲杠運動副 4.右絲杠運動副 5.右縫片驅動電機 6.右光耦 7.防碰撞光耦 8.右縫片 9.左縫片 10.左光耦

直線運動副的結構合理是實現左右縫片直線精確控制的前提條件，如未加彈簧消隙時，機構運動產生較大的震顫，無法達到設計要求的最小縫寬及重復定位精度需求，調整為圖4所示的彈簧阻尼消隙結構后，證明縫片運動可以滿足需求。

圖4　螺紋運動副消隙彈簧結構

4.2　狹縫縫片設計

縫片作為移動式狹縫的核心零件，其設計加工及裝校都有特殊要求。如圖5所示，在設計處理上，縫邊留有0.03mm的倒角，用以避免破壞刃口。刃口寬度設計為0.1mm，直線度0.002mm，各表面粗糙度達到P及P1。在材料選擇上要選用不銹鋼金屬材料，熱處理后進行表面研磨，其研磨效果直接關系到相關刃面的反射效果。除刃口端面外的其余表面鍍黑鉻處理，避免反射雜散光。縫片成對檢測，縫寬為0.002左右時在30X顯微鏡下觀察，縫紉清晰，間隙均勻，閉合時狹縫全長同時完全閉合，縫刃平直且合攏后無漏光。

圖5　縫片刃口形狀及公差要求

4.3　位置傳感器及消空回設計

位置傳感器使用歐姆龍EE-SX770A，定位精度2μm(圖6)。

圖6　光耦及狹縫觸發示意圖

如圖6所示，左側縫片從左觸發點向中間觸發點移動到剛好觸發停止，從左縫片觸發點開始計步，防碰傳感器剛好觸發的瞬間停止計步，重復100次，實驗記錄最大值為3075，最小值為3072，單側縫片步進2.5μm，對應差值7.5μm。證明縫片重復定位精度在10μm之內。對應的光譜帶寬選擇精度能夠達到1nm。

需要注意的是絲桿傳動副機構在運動中總是會有空回產生，雖然機構中增加了消隙彈簧，但并不能完全消除。因此在光耦傳感器的使用上往往在達到觸發點時，使運動機構多走一點，再反向運動重新觸發光耦，這樣單項運動可以充分消除運動機構自身的回程誤差給系統帶來的影響，也是精密運動時對光耦觸發常采用的方法。

4.4　狹縫機構的安裝固定

圖7為狹縫的安裝結構圖，狹縫機構垂直安裝在固定圓盤上，光路在固定圓盤上為分光結構，光路平行于水平基準面，狹縫設計安裝時，要求縫片與平面平行度誤差不大于0.05mm，因此需要在安裝狹縫的同時對狹縫機構水平度進行調校。這對可視化調校方面提出了較高就要求，本系統通過結合CCD(圖像傳感器)觀察狹縫縫片解決了這個問題。

圖7　狹縫機構安裝示意圖

5狹縫機構精度標定

縫片定位精度影響光譜帶寬的選擇精度，本系統縫片重復定位精度10μm。而縫片定位精度由提供定位基準的位置傳感器的定位精度、步進電機的運動精度以及狹縫絲杠傳動副的運動精度共同決定。位置傳感器定位精度2μm。電機為混合式步進電機，步長0.0025mm，該直線步進電機還可以進行微步進驅動以獲得精密的分辨率，并使電機運動時更為平滑，消除微弱顫動對狹縫精密運動帶來的影響。為精確標定縫片移動位置和波長的對應關系，用CCD將縫片所在的光譜面成像記錄下來，組成1∶1成像系統， CCD像元尺寸為4.4×4.4μm。

采用低壓汞燈和特定波長激光測量標定狹縫位置和波長的對應關系，用波段405nm、488nm、638nm的激光和低壓汞燈照明狹縫，用CCD探測結果。低壓汞燈含有5種波長的光：404.7nm、435.8 nm、546.1nm、577.0nm、579.1nm。將上下縫片分別移動到兩側光耦起始觸發點處，狹縫此時張開到最大值。固定左縫片后，移動右縫片至405nm、436nm、488nm、546nm、578nm、638nm對應的位置，重復操作，CCD探測的結果如圖8所示。

圖8　低壓汞燈及405nm、488nm、638nm激光譜線測試圖

檢測狹縫機構定位精度測試。狹縫縫片依靠步進電機驅動，讓電機多次運動，每次運動相同步數，觀察停止位置的差異，驗證狹縫組件總的定位精度。具體實現時，以光耦為運動起點，擋片離開光耦時開始計數，運動700步，重復多次，停止位置偏差2~3像素，說明狹縫組件重復性為10μm左右。

測試結果證明，移動式狹縫機構不論是狹縫運行速度，還是狹縫重復定位精度都能夠較好滿足整體設計參數需求。

6結論

通過實際應用效果研判，本狹縫機構能夠完成整體設計指標要求。即譜帶范圍涵蓋波長400~700nm，出射狹縫寬度最小達到了50μm，對應5nm光譜帶寬，調節范圍在0.05～6.7mm。該狹縫結構設計合理，調節方便，響應時間快，結構精巧實用，滿足了激光共聚焦顯微鏡光譜掃描的需求。

參考文獻

[1]Zhang Yunhai,Hu Bian, Dai Yakang, et al.A New Multichannel Spectral Imaging Laser Scanning Confocal Microscope. Computational and Mathematical Methods in Medicine， 2013: doi:10.1155/2013/890203.

[2]張運海,楊皓旻,孔晨暉.激光掃描共聚焦光譜成像系統.光學精密工程，2014,22(6)：44-51.

[3] 肖昀,張運海,武曉東,檀慧明.三層介質中激光掃描共聚焦顯微鏡的模型.激光與光電子學進展. 2014, 2014,51, 041701.

[4] 肖昀,張運海,王真,黎發志.入射激光對激光掃描共聚焦顯微鏡分辨率的影響.光學精密工程, 2014,22(1):31-38.

[5]James B Pawley.Handbook of Biological Confocal Microscopy. New York:Springer Science+Business Media,2006.

[6] 黃維,張運海,張龍,陳瑞濤,高飛,薛曉君.一種提高共焦顯微成像信噪比的積分采樣方法[J].電子測量技術,2013,36(7):48-61.