miR302/367簇對肝癌細胞增殖的抑制作用及機制探討

·基礎研究·

miR302/367簇對肝癌細胞增殖的抑制作用及機制探討

廖娟，雎巖，趙金，李潔，李濤

(陜西省腫瘤醫院，陜西咸陽710061)

摘要：目的探討miR302/367簇在肝癌發生、發展過程中的作用及機制。方法通過實時定量PCR檢測肝癌細胞系(Bel-7402、HepG2、MHCC97、SMMC-7721)中miR302/367簇的表達；在HepG2、MHCC97肝癌細胞系中建立miR302/367簇過表達體系，通過細胞計數實驗、MTT實驗和異種移植瘤模型檢測肝癌細胞體內、體外增殖和生長能力；利用流式細胞術，通過PI染色，檢測肝癌細胞周期分布。結果miR302/367簇在四個肝癌細胞系中均不表達；過表達miR302/367簇后，肝癌細胞體內、體外的增殖和生長能力均明顯受抑制，其G0/G1期比例顯著增加，而S期比例明顯減少(P均<0.05)。結論 miR302/367簇通過阻滯細胞從G0/G1期向S期轉換抑制肝癌細胞的增殖。

關鍵詞：肝腫瘤；微小RNA；miR302/367簇；細胞增殖

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.012

中圖分類號：R735.7文獻標志碼：A

收稿日期：(2015-09-08)

肝癌的發生、發展是一個多因素、多步驟的復雜過程，癌基因的激活和抑癌基因的失活是細胞發生癌變的主要機制。近年研究表明，miRNA參與了細胞的增殖、分化與凋亡等生理過程，其表達異常與腫瘤的起源與進展密切相關[1]。已有大量報道顯示，miRNA在肝癌組織中表達異常，如miR16、miR21、miR31、miR122、miR145等，與肝癌的發生、發展、轉移及預后相關[2, 3]。然而，miR302/367簇在肝細胞癌中的作用及分子機制目前尚不明確，本研究進行了相關探討。

1材料與方法

1.1材料細胞：人肝癌細胞系Bel-7402、HepG2、MHCC97、SMMC-7721和畸胎瘤細胞系PA-1購自美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)，用含10%胎牛血清、1 000 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的RPMI1640或DMEM細胞培養液，于37 ℃、5% CO2的條件下培養，待單層細胞生長達80%融合時，用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞備用。試劑及儀器：細胞培養液RPMI1640和DMEM購自Gibco BRL公司；氨芐青霉素鈉，硫酸鏈霉素和G418試劑購自美國Sigma公司；胎牛血清購自Hyclone公司；TRIzol，轉染試劑脂質體(LipofectaminTM2000)購自Invitrogen公司；microRNA逆轉錄試劑盒及Real-time PCR試劑盒均購自美國Applied Biosystems公司。

1.2載體構建及細胞轉染miR302/367簇位于人4號染色體4q25，包括miR302b、miR302c、miR302a、miR302d和miR367 5種miRNA[4]。從人肝癌細胞系HepG2基因組DNA中克隆了一段長723 bp的序列，將目的片段插入到miR-367前體miRNA的過表達載體(pCAG-EGFP-Neo)中并測序鑒定，構建miR302b、c、a、d和pCAG-EGFP-Neo。收集對數生長期的肝癌細胞，將5×105的細胞接種于6孔板中培養24 h。根據脂質體轉染說明書，將轉染試劑Lipofectmine2000與miR302/367簇過表達載體(實驗組)或pCAG-EGFP-Neo載體(對照組)混合，轉染24 h后觀測熒光，同時以1∶10的比例將每組細胞傳代，用G418藥物篩選挑取單克隆，通過實時定量PCR檢測其表達。

1.3細胞cDNA中miR302/367簇的檢測采用實時定量PCR法檢測肝癌細胞系(Bel-7402、HepG2、MHCC97和SMMC-7721)cDNA中miR302/367簇的表達，并選取畸胎瘤細胞系PA-1作為陽性對照。為進一步研究miR302/367簇在肝癌細胞中的作用，我們在HepG2和MHCC97細胞系中建立miR302/367簇過表達體系，并采用同樣方法檢測miR302/367簇的表達。收集對數期生長細胞，根據TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA，并利用特異性miRNA引物及TaqMan?miRNA reverse transcription kit反轉錄總RNA。利用TaqMan microRNA assay 和TaqMan universal PCR master mix試劑盒檢測cDNA中miR302/367簇的表達，其表達水平采用2-ΔCt方法，高度保守的snRNA U6作為內參。結果在這4個肝癌細胞系中，miR302/367簇中5種miRNA均不表達，而在PA-1中均高表達。轉染miR302/367簇后，GFP陽性克隆均能表達5種miRNA。將過表達克隆(HepG2-302/367組和MHCC97-302/367組)與對照克隆(HepG2-EGFP組和MHCC97-EGFP組)用于后續研究。

1.4體外細胞增殖能力和細胞活力檢測細胞增殖能力檢測：采用細胞計數實驗。收集對數生長期細胞，以5×104個細胞接種于6孔板中，利用細胞計數器檢測1周內細胞數并繪制細胞生長曲線，比較實驗組(HepG2-302/367組和MHCC97-302/367組)和對照組(HepG2-EGFP組和MHCC97-EGFP組)中細胞增殖能力的差異。細胞活力檢測:采用MTT法。將1 000個細胞接種于96孔板中，加入MTT后37 ℃培養4～6 h，然后加入DMSO溶解，用分光光度計于570 nm處測定吸光度并繪制曲線圖。連續7 d檢測細胞活力。

1.5體內細胞增殖、生長和成瘤能力檢測采用異種移植瘤實驗。取對數生長期的實驗組(HepG2-302/367組和MHCC97-302/367組)和對照組(HepG2-EGFP組和MHCC97-EGFP組)中細胞，經胰酶消化成單細胞懸液，調整濃度，終濃度為1×106/mL，將100 μL(1×105個)細胞懸液接種于4～6周齡的BALB/c-nu裸鼠(購自上海斯萊克公司)雙側背部皮下，連續觀察6～8周，每周觀察腫瘤的生長情況并記錄。

1.6細胞周期檢測取對數生長期的實驗組(HepG2-302/367組和MHCC97-302/367組)和對照組(HepG2-EGFP組和MHCC97-EGFP組)中細胞，利用流式細胞術，通過PI染色，檢測肝癌細胞周期分布。

2結果

2.1miR302/367簇對肝癌細胞體外增殖、細胞活力的影響miR302/367簇干預后肝癌細胞的增殖能力明顯受抑。7 d的培養期中，HepG2-302/367和MHCC97-302/367與HepG2-EGFP和MHCC97-EGFP相比，其細胞數分別下降了3倍和2倍(P均<0.05)。結果見表1。MTT實驗亦顯示miR302/367簇能明顯抑制肝癌細胞生長。通過7 d的培養，HepG2-302/367和MHCC97-302/367與對照相比，其細胞活力均明顯降低(P均<0.05)。結果見表2。

表1　各組不同時間的細胞數比較(×10 4個，

注：與HepG2-EGFP組比較，*P<0.05；與MHCC97-EGFP組比較，#P<0.05。

表2　各組不同時間的細胞活力比較(吸光度值， ± s)

注：與HepG2-EGFP組比較，*P<0.05；與MHCC97-EGFP組比較，#P<0.05。

2.2miR302/367簇對肝癌細胞體內增殖、生長和成瘤能力的影響過表達miR302/367簇后，肝癌細胞成瘤時間、成瘤率并未見明顯變化，HepG2-302/367、MHCC97-302/367實驗組和HepG2-EGFP、MHCC97-EGFP對照組在3周左右均可觸摸到結節，成瘤率均為100%。但與對照組相比，過表達組移植瘤的生長速度明顯減慢(表3，P<0.05)。裸鼠處死后取下腫瘤稱重，HepG2-302/367組和HepG2-EGFP組體質量分別為(1.37±0.57)、(2.72±0.92)g，MHCC97-302/367組和MHCC97-EGFP組體質量分別為(1.16±0.53)、(1.93±0.77)g，miR302/367簇過表達后體質量明顯減輕(P<0.05)。

表3　各組不同時間的腫瘤體積比較 ± s)

注：與HepG2-EGFP組比較，*P<0.05；與MHCC97-EGFP組比較，#P<0.05。

2.3miR302/367簇對肝癌細胞周期的影響結果見表4。

3討論

miRNA是一種細胞內源性的非編碼小RNA，長19～22 nt，可通過特異性結合來降解mRNA或抑制其翻譯，從而調節蛋白表達[5]。已有實驗證實，miRNA參與細胞的多種生理和病理過程，如細胞分化、增殖、凋亡及腫瘤形成等[5]。miR302/367簇能促進胚胎干細胞的多潛能性，參與腫瘤的發生、發展。本研究旨在研究該基因簇在肝癌中的作用及機制。

表4　各組細胞周期分布比例比較 ± s)

注：與HepG2-EGFP組比較，*P<0.05；與MHCC97-EGFP組比較，#P<0.05。

miR302/367簇包括5個miRNA(miR302b、miR302c、miR302a、miR302d和miR367)。由于miR302a-d具有相同的種子序列，與miR367存在不同，因此大部分的文獻均只研究miR302s[6,7]，僅有為數不多的文獻報道了miR302/367簇的功能[8,9]。該基因簇中的5個miRNA位于同一前體miRNA，其共轉錄本由共同的啟動子調控轉錄，該啟動子位于Larp7基因的8號內含子[10]。因此，這5個miRNA表達一致，應作為一個整體共同研究其功能。我們前期研究結果顯示，4個肝癌細胞系中均不表達5個miRNA，而在畸胎瘤細胞系中均有表達，且表達水平一致。Suh等也報道了miR302/367簇在多潛能細胞中的特異性表達。

關于miR302s功能研究有不同的結果。有報道顯示，miR302s能誘導人體細胞(成纖維細胞和毛囊濾泡細胞)和腫瘤細胞(Colo-829 黑色素瘤和PC3前列腺癌)形成誘導多能活細胞[7]，而另一部分報道顯示miR302s能抑制人多潛能干細胞和多種腫瘤細胞的成瘤能力。同樣的，miR302/367簇亦能誘導人成纖維細胞形成多潛能胚胎干細胞樣細胞[8]。在本研究中，我們并未發現miR302/367簇在肝癌細胞中具有重編程作用，但能通過抑制細胞周期進程從而抑制肝癌細胞增殖。在肝癌細胞系中過表達miR302/367簇后，可抑制細胞體內、外增殖和生長能力，這一過程是通過阻滯細胞從G0/G1期向S期轉換實現的。

在以往的研究中，亦有文獻報道了miR302/367簇抑制周期進程的分子機制。miR302s能下調多種細胞周期相關蛋白，包括CDK2、cyclin A、E2F-1、cyclin D1等[11]。在宮頸癌中，miR302/367簇能通過直接靶向AKT1，上調p27Kip1和p21Cip1這兩個周期抑制蛋白，從而阻滯細胞從G0/G1期向S期轉換[15]。

綜上所述，miR302/367簇能通過阻滯細胞從G0/G1期向S期轉換，從而抑制肝癌細胞的增殖能力，在肝癌的發生發展過程中發揮抑癌基因的作用。該研究為進一步探索肝癌的生物學機制及將miR302/367簇作為潛在的治療靶點提供了理論基礎。

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