對凝血酶誘導血小板活化分子機制的研究

孫海燕 毛德奎 董俏言 于愛平★

（1.威海衛人民醫院 山東 威海 264200；2.中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所 北京 100850）

血小板是血液中的重要成分，其在保持血管的完整性及防止血管損傷后出血等方面均發揮重要的作用。血小板是人體防御出血的重要機制，此防御機制與血小板的活化聚集密切相關。但是，血小板過度的活化聚集又會導致血栓形成，甚至會引發急性心肌梗死、腦卒中和 不穩定型心絞痛等血栓栓塞性疾病[1-3]。PI3K/Akt信號通路是血小板活化過程中的重要信號轉導途徑[4]。PI3K通路的活化可導致細胞周期蛋白（Cyclin）等蛋白表達水平的上調，促進G1期的進展，從而加速細胞代謝的周期，促進細胞的增殖和分化。PTEN蛋白是PI3K/AKT信號通路的負調控因子，PTEN蛋白可抑制PI3K/AKT信號通路的激活。PTEN/ PI3K/Akt的信號通路已被證實在腫瘤的發生、發展中具有重要的作用，然而該通路在凝血酶誘導血小板活化的過程中是否具有相應的作用還有待于進行深入的研究。為了進一步探討凝血酶誘導血小板活化分子的機制，為研發阻斷血小板活化的抗血小板聚集類藥物提供理論依據，筆者對36例健康人的血液標本的實驗資料進行回顧性研究。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究的對象為36例健康人的血液標本。這36例健康人均符合以下情況：①其在進行實驗前的2周內均未服用過藥物。②其均無吸煙史。在這36例健康人中，有男性20例，女性16例。他們的年齡在20歲～29歲之間。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗試劑 本次研究所使用的抗體均購自Cell Signaling Technology公司，Thrombin（凝血酶）、Apyrase（ATP酶抑制劑）均購自 sigma公司，PGE1（前列腺素E1）購自Cayman Chemical公司，BCA法蛋白定量試劑盒購自Thermo公司。

1.2.2 制備血小板的方法 按照靜脈采血指南中的操作方法，用濃度為3.8%（w/v） 的枸櫞酸鈉抗凝管采集研究對象肘部的靜脈血液作為標本。將血液標本輕微混勻，以1000 rpm的轉速對血液標本進行15 min的離心處理后，吸取上層血漿，即得到PRP（富血小板血漿）。向PRP中加入終濃度為5 mM的EDTA（乙二胺四乙酸）、0.1μg/mL的PGE1、1 U/mL 的Apyrase溶液，靜置20min。然后，以2000rpm的轉速對此溶液進行10min的離心處理后即獲得血小板沉淀液，棄上清液。將制取的血小板重懸于HEPES-Tyrode（臺氏液）緩沖液中，將血小板的終濃度調整為106/μL。

1.2.3 對凝血酶進行處理的方法 將0.5U/mL的Thrombin與血小板 在 37℃ 的恒溫培養箱中用不同的時間共同孵育，或配置不同濃度的Thrombin與血小板在37℃的恒溫培養箱中共同孵育8h。將共同孵育后的實驗樣本加入細胞裂解液，進行冰浴30 min后，以12000 rpm的轉速在4℃下進行15 min的離心處理，取上清液測量其蛋白質的濃度后備用。另取不做任何處理的血小板作為空白對照標本。

1.2.4 進行 Western blot 實驗的方法 將蛋白樣品經SDSPAGE凝膠電泳后，轉印至PVDF膜上。使用目的蛋白（Akt、p-Akt、PTEN、p21、p27和skp2）一抗分別與PVDF膜共同孵育。在孵育結束后，用HRP標記的相應二抗處理雜交一抗的PVDF膜，最后在暗室 對PVDF膜進行顯影。將GAPDH作為內參蛋白，樣品中目的蛋白的相對含量以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

1.3 統計學處理 我們使用SPSS16.0軟件包對本次實驗中的數據進行處理，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 凝血酶激活血小板P I3K/Akt信號通路的結果Akt蛋白是PI3K的下游效應蛋白，Akt磷酸化是PI3K通路被激活的標志。本次研究主要通過檢測Akt磷酸化的水平來判斷PI3K/Akt的信號通路是否被激活。結 果顯示，凝血酶能夠激活血小板的PI3K/Akt的信號通路（如圖2-1所示）。在加入凝血酶后能夠顯著上調血小板中p-Akt蛋白的表達水平。隨著凝血酶作用時間的延長，血小板中p-Akt蛋白的表達水平明顯上調，且具有時間依賴效應。 在進行凝血酶處理的20min后，血小板中p-Akt蛋白的表達水平最高。隨著凝血酶處理時間的進一步延長，血小板中Akt磷酸化的水平并沒有顯著升高。另外，在使用不同濃度的凝血酶對血小板進行處理的8h后，血小板中p-Akt蛋白的表達水平明顯上調，此效應在一定范圍內具有濃度依賴效應（如圖2-2所示）。在凝血酶的濃度達到4U/mL時，血小板中p-Akt蛋白的表達水平最高。

圖2-1 凝血酶與血小板中的AKT磷酸化水平的時效關系

圖2-2 凝血酶與血小板中的AKT磷酸化水平的量效關系

2.2 凝血酶抑制PTEN蛋白表達的結果 PTEN蛋白是PI3K/AKT信號通路的負調控因子。為了明確凝血酶對PI3K/Akt信號通路的活化機制，我們進一步測定了PTEN蛋白的表達情況（如圖2-3和圖2-4所示）。與空白對照血小板標本相比，實驗標本在加入凝血酶后，血小板中PTEN蛋白的表達水平顯著下調，且具有時間和濃度的依賴效應。

圖2-3 凝血酶與血小板中PTEN表達的時效關系

圖2-4 凝血酶與血小板中PTEN表達的量效關系

2.3 凝血酶抑制周期蛋白p21蛋白和p27蛋白表達的結果 通過檢測凝血酶對PI3K/Akt信號通路的下游分子--細胞周期調控蛋白p21和p27蛋白的表達水平，可以判斷出凝血酶對PI3K/Akt信號通路的影響。本次研究結果顯示，凝血酶可顯著下調血小板中p21和p27蛋白的表達水平，且其抑制效果會隨著時間和凝血酶濃度的增加而加強（如圖2-5至2-8所示）。

圖2-5 凝血酶與血小板中p21表達的時效關系

圖2-6 凝血酶與血小板中p21表達的量效關系

圖2-7 凝血酶與血小板中p27表達的時效關系

圖2-8 凝血酶與血小板中p27表達的量效關系

3 討論

血小板是由成熟的巨 核細胞裂解產生的人體含量最多的無核細胞[5]。血小板在止血、消炎和傷口愈合的過程中均發揮著重要的作用。凝血酶作為血小板活化的主要配體之一，在血栓的發生和發展中具有重要的作用。但是，凝血酶在激活血小板表面相應的蛋白酶活化受體后，血小板內還有哪些細胞內分子或信號通路參與該活化作用尚未得到完全的證實。PI3K可以被多種炎癥趨化因子、細菌毒素及血管活性激動劑激活，在炎癥、癌癥及心血管疾病的發生、發展的過程中發揮重要的作用[6-8]。有研究發現，PI3K通路是調節血壓及血栓形成的重要轉錄途徑，PI3K通路主要是通過激活其下游效應蛋白Akt的磷酸化而發揮作用。經凝血酶活化前后，血小板內關鍵蛋白的表達水平會發生變化，活化后的血小板內的Akt在絲氨酸473位點發生磷酸化，使PI3K/Akt的信號通路被激活。細胞周期蛋白p21 和p27主要通過對細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的抑制作用來阻斷G1期到S期的轉換，實現對細胞周期的負調控。細胞S期激酶相關蛋白2（Skp2）是SCF 泛素連接酶復合體的特異底物識別亞單位F-box蛋白家族的成員之一，此蛋白可特異性地作用于細胞周期蛋白[9]，使其通過泛素-蛋白質酶體的途徑降解，從而調控G1期向S期的轉換。

綜上所述，凝血酶可通過激活血小板內的PTEN/PI3K/Akt的信號通路而發揮作用，并可通過調控血小板內細胞周期蛋白的表達誘導血小板的活化。

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