熟眠膠囊對失眠模型大鼠腦內不同組織5-HT1a、5-HT2a受體表達的影響

熟眠膠囊對失眠模型大鼠腦內不同組織5-HT1a、5-HT2a受體表達的影響

王冰梅1，許峰2，王中男2*

(1.長春中醫藥大學基礎醫學院，長春 130117；2.長春中醫藥大學第一附屬醫院，長春 130117)

摘要：目的觀察熟眠膠囊對失眠大鼠腦內5-HT1a、5-HT2a受體表達的影響。方法將成年雄性Wistar大鼠60只隨機分為正常對照組(N組)、失眠模型組(M組)、地西泮組(D組)、熟眠膠囊高、中、低組(SM-H、SM-M、SM-L組),每組10只，采用腹腔注射PCPA法造模。造模成功后，給藥組分別給予熟眠膠囊(28，14，7 g/kg)、地西泮(0.525 mg/kg)，N組、M組給予相應容量的蒸餾水，連續給藥7 d,分別觀察各組大鼠下丘腦、海馬內5-HT1a、5-HT2a受體mRNA表達量的變化。結果與N組相比，M組下丘腦、海馬5-HT1a表達量明顯降低、5-HT2a表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05、P<0.05);與M組相比，D組下丘腦、海馬5-HT1a表達量明顯升高、5-HT2a表達量明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05、P<0.05)；與M組相比，SM-H、SM-M組下丘腦、海馬5-HT1a表達量明顯升高(P<0.05、P<0.05)、5-HT2a表達量明顯降低(P<0.05、P<0.05),差異有統計學意義。結論熟眠膠囊可以通過調節失眠模型大鼠下丘腦、海馬中5-HT1a、5-HT2amRNA的表達發揮治療作用。

關鍵詞：熟眠膠囊；失眠；5-羥色胺1a受體；5-羥色胺2a受體

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.03.022

中圖分類號：R256.23文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)03-0286-03

基金項目:吉林省科學技術廳課題(20110930)。

作者簡介:王冰梅(1970-)，女，博士，副教授，主要從事中西醫結合基礎研究。

收稿日期:(責任編輯：張瑞彬2014-02-10)

*通信作者:王中男，電話-(0431)86172503，電子信箱-zhongnanw@sina.com

Effects of Shu-Mian Capsule on 5-HT1a、5-HT2areceptor mRNA expression of

different brain tissue of insomnia rat

WANG Binmei1,XU Feng2,WANG Zhongnan2*

(1.Department of Physiology,College of Basic Medical,Changchun University of TCM,Changchun 130117,China;

2.First Affiliated Hospital of Changchun University of TCM,Changchun 130117,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of Shu-Mian Capsule on the expression of 5-HT1a and 5-HT2a receptors in Insomnia rats’ brain.MethodsSixty male Wistar rats were randomly divided into control (N group),insomnia model (M group),Diazepam (D group),and high,middle and low dose group of Shu-Mian Capsule groups(SM-H、SM-M、SM-L group respectively),with 10 cases in each,and the insomnia model rats were made by intraperitoneal injection of PCPA.The rats of SM-H、SM-M、SM-L group were subsequently administrated with Shu-Mian Capsule at a dose of 28 g/kg,14 g/kg,7 g/kg respectively,while rats in D group with Diazepam at a dose of 0.525 mg/kg,and rats in M and N groups with the same volume of distilled water.The treatment lasted for 7 days.Then the expression of 5-HT1a and 5-HT2a receptors mRNA in hypothalamus and hippocampus in each rat were investigated.ResultsCompared with the control (N) group,the expression of 5-HT1a mRNA in hypothalamus and hippocampus in rats from M group decreased significantly,while the 5-HT2a mRNA increased significantly(P<0.05,P<0.05).Compared with M group,the expression of 5-HT1a mRNA in hypothalamus and hippocampus in rats from D group increased significantly,while the 5-HT2a mRNA decreased significantly (P<0.05,P<0.05).Compared with M group,the expression of 5-HT1a mRNA in hypothalamus and hippocampus in rats from SM-H and SM-M groups increased significantly,while the 5-HT2a mRNA decreased significantly (P<0.05,P<0.05).ConclusionThe therapeutic effect of Shu-Mian capsule maybe performed by the regulating of the expression of 5-HT1a and 5-HT2a mRNA in the insomnia model rats’ hypothalamus and hippocampus.

Keywords:Shu-Mian Capsule;Insomnia;serotonin 1a receptor;serotonin 2a receptor

失眠可引起人或動物出現疲勞、思維紊亂，常伴不良的情緒變化。5-羥色胺(5-HT)是睡眠調節最為重要的神經遞質之一，腦組織內5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達量可以反映5-HT對睡眠的調節機制。熟眠膠囊在臨床上治療失眠癥療效確切。本實驗通過研究熟眠膠囊對失眠模型大鼠下丘腦、海馬內5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達量的影響，探討其改善睡眠的作用機制。

1實驗材料

1.1實驗動物成年雄性Wistar大鼠60只，購自吉林大學實驗動物中心，合格證號2013A015，體質量180～220 g。動物于實驗前1周適應環境，自由進食、飲水。

1.2實驗儀器和試劑臺式高速冷凍離心機(LECEND MICRO 21R)，Thermo；7500實時熒光定量PCR，美國ABI；PCPA，美國Sigma公司；柱式Trizol總RNA提取試劑盒，上海生工公司；TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒，北京全式金公司；PCR引物合成，上海生工公司。

1.3藥物熟眠膠囊，由長春中醫藥大學附屬醫院制劑室提供；地西泮，江蘇濟川制藥有限公司生產。

2實驗方法

2.1分組及造模將Wistar大鼠隨機分組為正常組(N組)和實驗組,正常組10只，實驗組若干只。實驗組大鼠腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA)(300 mg/kg)，連續2 d，1次/d，正常組每日注射生理鹽水。于第1次注射PCPA 48 h后應用閾劑量戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行睡眠實驗，以大鼠睡眠潛伏期和睡眠持續時間為指標，評價造模成功與否。取模型制備成功的實驗組大鼠50只，隨機分為5組,分別為失眠模型組(M組)、地西泮組(D組)、熟眠膠囊高、中、低組(SM-H、SM-M、SM-L組)，每組10只。

2.2給藥N組、M組大鼠灌胃生理鹽水2 mL，1次/d；D組灌胃地西泮0.525 mg/kg，1次/d；SM-H、SM-M、SM-L組灌胃熟眠膠囊(28，14，7 g/kg)，給藥劑量按動物與人體每千克體質量計量折算系數換算,系數為6.25[1]，1次/d,連續給藥7 d。

2.3實時熒光定量PCR檢測下丘腦、海馬5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達 于末次給藥2 h后，各組動物在冰臺上斷頭取下丘腦、海馬組織，放入液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱保存。所有試驗器材都經滅活RNA酶處理。采用柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取大鼠下丘腦、海馬組織標本中的總RNA；TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA后測定下丘腦、海馬中的5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達量。

以GAPDH作內參，采用2-ΔΔCt法分析大鼠下丘腦、海馬5-HT1a、5-HT2a受體的基因相對表達量。2-ΔΔCt法相對定量分析結果判定：循環閾值(ΔCt)=Ct樣品均值-Ct內參均值，ΔΔCt=ΔCt-(Ct陰性對照樣品均值-Ct內參均值)。

實驗熒光定量PCR檢測引物為:GAPDH上游引物5’-acatgccgcctggagaaacct-3’，下游引物5’-gcccaggatgccctttagtgg-3’；5-HT1a上游引物5’-ccgcacgcttccgaatcc-3’，下游引物5’-tgtccg ttcaggctcttcttg-3’；5-HT2a上游引物5’-aacggtccatccacagag-3’，下游引物5’-aacaggaagaacacg atgc-3’。PCR擴增條件為:95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，共40個循環。

3實驗結果

3.1熟眠膠囊對失眠模型大鼠下丘腦、海馬組織5-HT1amRNA表達量的影響給藥結束后，各組大鼠下丘腦、海馬組織5-HT1amRNA的相對表達量比較，差異有統計學意義。與M組比較,SM-H組下丘腦、海馬組織5-HT1amRNA表達水平明顯升高(P<0.01,P<0.01)；SM-M下丘腦、海馬組織5-HT1amRNA表達水平升高(P<0.05，P<0.05)；SM-L組下丘腦、海馬組織5-HT1amRNA表達水平的升高無統計學意義(P>0.05,P>0.05)；SM-H組與D組比較無統計學意義(P>0.05)。上述結果表明，熟眠膠囊可提高下丘腦、海馬組織中的5-HT1amRNA的表達，與地西泮藥效相近。結果見表1。

組 別下丘腦海馬N組0.93±0.10 0.71±0.07 M組0.68±0.09 0.45±0.06 SM-H組0.82±0.08##△0.56±0.07##△SM-M組0.78±0.04# 0.53±0.07# SM-L組0.75±0.08 0.51±0.06 D組0.88±0.08## 0.63±0.06#

注：與M組相比#P<0.05；與M組比較##P<0.01；與D組比較△P>0.05

3.2熟眠膠囊對失眠模型大鼠下丘腦、海馬組織5-HT2amRNA表達量的影響給藥結束后，各組大鼠下丘腦、海馬組織5-HT2amRNA的相對表達量存在統計學差異。與M組比較，SM-H組下丘腦、海馬組織5-HT2amRNA表達水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)；SM-M下丘腦、海馬組織5-HT2amRNA表達水平降低(P<0.05，P<0.05)；SM-L組下丘腦、海馬組織5-HT2amRNA表達水平的降低無統計學意義(P>0.05，P>0.05)；SM-H組與D組比較無統計學意義(P>0.05)。上述結果表明，熟眠膠囊可降低下丘腦、海馬組織中的5-HT1amRNA的表達，與地西泮藥效相近。結果見表2。

組 別下丘腦海馬N組0.69±0.09 0.35±0.12 M組0.90±0.07 0.71±0.10 SM-H組0.75±0.08##△0.54±0.11# SM-M組0.79±0.06# 0.56±0.10# SM-L組0.83±0.07 0.63±0.10 D組0.68±0.09## 0.41±0.11##

注：與模型組相比#P<0.05；與模型組比較##P<0.01；與安定組比較△P>0.05

4討論

熟眠膠囊是王中男教授的多年臨床驗方，該方以歸脾湯為基礎，由人參、麥冬、當歸、酸棗仁、五味子等中藥組成，在臨床上取得了良好的療效。歸脾湯治療失眠在臨床上多有報道，孫紹華等[2]應用加味歸脾湯治療失眠癥50例，葉人等[3]應用歸脾湯結合睡眠衛生宣教對心脾兩虛型亞健康失眠患者進行干預,本科室[4]也報道了歸脾熟眠湯治療心脾兩虛證失眠患者32例，均取得了良好的臨床效果，但對其治療失眠的作用機制尚未見研究報道。

5-HT能系統的功能涉及抑郁、損傷性應激、睡眠以及覺醒的調節等，其在觸發和維持睡眠中起重要作用。5-HT合成抑制劑對氯苯丙氨酸(PCPA)可拮抗5-HT前體5HTP來引起失眠，腹腔注射PCPA引起的大鼠失眠是公認的動物失眠模型，肖成榮等[5]報道，PCPA連續給藥2 d，第3天時大鼠下丘腦、海馬組織中5-HT含量均降低；第7天大鼠的睡眠和自發活動都會迅速恢復到正常水平，而其腦中的5-HT含量仍低于正常水平的50%。

5-HT受體分為7個類型(5-HT1-7)，每個類型又分為多種亞型,在抗失眠研究最受到關注是5-HT1a和5-HT2a受體。研究表明5HT1a受體激動藥具有減少快速動眼睡眠(REM)、增加REM潛伏期、升高腦內5HT含量的作用[6]。 研究表明[7]選擇性5-HT2a受體拮抗劑可增加慢波睡眠(SWS)和非快速動眼睡眠(NREM)，減少覺醒次數且無對于REM的影響，因此認為5-HT2a受體拮抗藥物是治療失眠的比較理想藥物。

熟眠膠囊可提高下丘腦及海馬內5-HT1a受體mRNA含量，降低5-HT2a受體mRNA含量，提示熟眠膠囊可能是通過影響下丘腦及海馬內5-HT1a、5-HT2a受體表達調節下丘腦及紋狀體內5-HT能系統的作用，從而起到治療失眠的作用。

參考文獻：

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[2]孫韶華,莫中周,李新平,等.加味歸脾湯治療失眠癥50例[J].陜西中醫,2005,26(2):129-130.

[3]葉人,袁拯忠,戴春秀,等.歸脾湯結合睡眠衛生宣教對心脾兩虛型亞健康失眠干預作用的臨床研究[J].中國中藥雜志,2011,36(16):2285-2288.

[4]張昊,吳九如,王中男.歸脾熟眠湯治療心脾兩虛證失眠患者32例臨床觀察[J].中醫雜志,2014,55(16):1390.

[5]肖成榮,馬增春,李海靜,等.PCPA失眠大鼠模型的制作及其機制[J].毒理學雜志,2007,21(4):326.

[6]Sue J WILSON,JAYNE E BAILEY,ANN S RICH,et al.The use of sleep measures to compare a new 5HT1aagonist with buspirone in humans [J].Nutt J Psychopharmacol,2005,19(6):609-613.

[7]FISH L R,GILLIGAN M T,HUMPHRIES A C,et al.4-Fluorosulfonylpiperidines:selective 5-HT2aligands for the treatment of insomnia [J].Bioorg Med Chem Lett ,2005,15(16):3665-3669.