云南省馬鈴薯脫毒試管苗和微型薯病毒檢測與分析

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云南省馬鈴薯脫毒試管苗和微型薯病毒檢測與分析

張麗珍，董家紅*，鄭寬瑜，吳闊，蘇曉霞，方琦，張仲凱*

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650223 )

摘要：病毒病是制約馬鈴薯產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素。馬鈴薯脫毒試管苗、微型薯是生產(chǎn)脫毒種薯的重要環(huán)節(jié)。本研究于2010~2013年對收集自云南省的試管苗274個(gè)、微型薯356個(gè)，共計(jì)630個(gè)樣品。應(yīng)用電子顯微鏡觀察，并采用DAS-ELISA檢測了8種病毒：馬鈴薯S病毒、馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯M病毒、番茄斑萎病毒和煙草環(huán)斑病毒，發(fā)現(xiàn)試管苗和微型薯中馬鈴薯S病毒檢出率最高（21.27%），其次是PLRV(5.71%)；還檢測到了新出現(xiàn)的侵染馬鈴薯的番茄斑萎病毒和煙草環(huán)斑病毒。研究結(jié)果為馬鈴薯種薯生產(chǎn)過程中病毒病的檢測防控提供了參考。

關(guān)鍵詞：試管苗；微型薯；脫毒種薯；主要病毒；檢出率；分析

馬鈴薯是云南省的優(yōu)勢農(nóng)作物，是云南發(fā)展高原特色農(nóng)業(yè)打造的“十二大品牌”之一，2012年總種植面積58.6萬hm2，總產(chǎn)量842.5萬t，但平均單產(chǎn)14.38 t/hm2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于世界上最高的國家荷蘭的平均單產(chǎn)（50 t/hm2）水平，也低于全國平均水平（22.5t/hm2）。

馬鈴薯以營養(yǎng)體為繁殖材料，容易被病毒感染，并傳播擴(kuò)散到子代，造成病害逐年嚴(yán)重，產(chǎn)量逐年降低，種薯種質(zhì)嚴(yán)重退化[1]。目前報(bào)道感染危害馬鈴薯的病毒有40余種，且不斷有新病害發(fā)生[2,3]。近年來在中國影響馬鈴薯產(chǎn)業(yè)比較嚴(yán)重的主要有馬鈴薯X病毒（Potato virus X, PVX）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）、馬鈴薯S病毒（Potato virus S, PVS）、馬鈴薯A病毒（Potato virus A, PVA）、馬鈴薯M病毒（Potato virus M, PVM）以及馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus, PLRV）[3-6]。在缺乏抗性品種以及沒有有效的病毒病防治藥劑的情況下，目前最有效的防控馬鈴薯病毒病害的措施就是使用脫毒馬鈴薯。所以，在馬鈴薯生產(chǎn)中，優(yōu)質(zhì)的脫毒種薯是提高馬鈴薯產(chǎn)量和質(zhì)量的保障。

自20世紀(jì)80年代末期以來，為解決生產(chǎn)中馬鈴薯種薯的退化問題，云南省開始研究、推廣脫毒種薯，建立脫毒種薯生產(chǎn)體系及種薯質(zhì)量監(jiān)督檢測體系[6]。但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，由于各種薯生產(chǎn)單位技術(shù)水平參差不齊，尤其是缺少對種薯質(zhì)量的檢測能力，致使生產(chǎn)的種薯帶毒率較高。生產(chǎn)上缺乏合格的脫毒種薯是限制云南省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。脫毒種薯生產(chǎn)的核心環(huán)節(jié)首先要保證脫毒試管苗的帶毒率為零，所以摸清各種薯生產(chǎn)單位脫毒試管苗以及微型薯的帶毒情況，是生產(chǎn)健康優(yōu)質(zhì)的馬鈴薯種薯的重要保障。本研究對云南省種薯生產(chǎn)單位的試管苗、微型薯進(jìn)行了抽樣，通過電子顯微鏡負(fù)染色初步觀察，然后用酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測了云南省馬鈴薯脫毒試管苗和微型薯。檢測結(jié)果有利于掌握云南省馬鈴薯種薯質(zhì)量及病毒病發(fā)生情況，對馬鈴薯種薯生產(chǎn)過程中的病毒檢測和防控具有指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1樣品來源

2010~2013年，對云南省昆明、曲靖、昭通、麗江、迪慶、楚雄、大理等地州市的馬鈴薯生產(chǎn)單位和公司的馬鈴薯試管苗、微型薯進(jìn)行病毒檢測，品種主要為當(dāng)?shù)刂髟云贩N‘合作88’、‘會-2號’、‘大西洋’、‘麗薯6號’、‘宣薯2號’、‘費(fèi)烏瑞它’等。試管苗樣品采用隨機(jī)抽取，取自昆明、麗江、昭通、曲靖。微型薯樣品取自昆明、曲靖、昭通、麗江、迪慶、楚雄和大理，有花葉、黃化、矮化、卷葉和壞死等病毒癥狀的樣品，顯示明顯癥狀的樣品取單個(gè)樣品檢測，無明顯病毒病癥狀的隨機(jī)取樣，每地塊隨機(jī)取5點(diǎn)，每點(diǎn)取5株，催芽后各取一個(gè)芽眼混為1個(gè)樣。所采集的樣品有馬鈴薯脫毒試管苗274株，微型薯356株。

1.2方法

1.2.1電子顯微鏡負(fù)染色方法

取試管苗、薯塊芽組織，加入等體積的ddH2O后，用刀片均勻切至植物粗汁液溢出，用Formvar膜覆蓋的銅網(wǎng)蘸取粗汁液，用2%鉬酸銨負(fù)染色，置于JEM100CX-Ⅱ型透射電鏡下觀察病毒粒體形態(tài)特征[7]。

1.2.2ELISA方法

針對馬鈴薯主要病毒PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA和PVM進(jìn)行DAS-ELISA檢測，部分樣品根據(jù)電子顯微鏡負(fù)染色觀測結(jié)果還檢測了番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）、煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ringspot virus, TRSV）。馬鈴薯病毒檢測試劑盒購自美國Agdia公司，按照說明書進(jìn)行檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1電鏡觀察結(jié)果與分析

對于試管苗，全部制樣觀察，而微型薯，同一批次的樣品隨機(jī)取5個(gè)薯塊催芽后取芽眼制樣。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)20%以上的樣品能觀察到典型的病毒粒體，病毒粒體形態(tài)主要有如下4種：輕微彎曲線狀粒體，大小為515 nm×13 nm，初步判斷為PVX；等軸球狀粒體，直徑約30~40 nm，初步判斷主要為PLRV，其次可能是TRSV；剛直線狀粒體，大小為650 nm×12 nm，初步判斷為PVS；彎曲線狀的粒體，大小為760 nm×11 nm，初步判斷主要為PVY；部分樣品為被膜的球形病毒粒體，直徑為80~85 nm，初步判斷為番茄斑萎病毒屬病毒。

2.2ELISA檢測結(jié)果與分析

檢測試管苗274份樣品，總病毒檢出率為24.08%，檢測到了PVX、PVS、PVY、PVA、PLRV、TSWV，沒有檢測到PVM。TSWV從昆明的樣品檢出，而其它地方的試管苗沒有檢測到。其中檢測率最高的為PVS，檢出率為14.60%，其次為PLRV，檢出率為4.74%。昆明樣品中有3個(gè)樣品分別為PVY/PVS、PVA/PLRV、PVX/PVS/PLRV復(fù)合侵染，其余樣品沒有檢測到復(fù)合侵染情況（表1）。

表1　試管苗病毒檢測Table 1 Virus detection of invitroplantlets

檢測微型薯356個(gè)樣品，總病毒檢出率為35.11%，檢測到了PVX、PVS、PVY、PVA、PLRV、TSWV、PVM，與試管苗一樣僅從昆明樣品中檢測到了TSWV，昆明的1個(gè)樣品中檢測到TRSV。檢測率最高的2個(gè)病毒仍是PVS和PLRV，檢出率分別為26.40%和6.46%。檢測到10個(gè)樣品為復(fù)合侵染，主要是PVS/PLRV復(fù)合侵染（表2）。

表2　微型薯病毒檢測結(jié)果Table 2 Virus detection of minitubers

3　討論

自2010~2013年來，檢測云南省各地的274個(gè)試管苗和356個(gè)微型薯，共計(jì)630個(gè)樣品，檢出率最高的兩個(gè)病毒是PVS和PLRV，檢出率分別為21.27%和5.71%，這與張仲凱等[6]2003年報(bào)道的主要優(yōu)勢病毒PVX、PVY和PLRV有所不同，但病毒種類變化不大。白艷菊等[8]對2004～2005年云南省的2個(gè)試管苗樣品和28個(gè)原原種樣品檢測結(jié)果，試管苗帶毒率100%，原原種帶毒率64.28%，主要是PVS和PVY，復(fù)合侵染嚴(yán)重。本研究結(jié)果與白艷菊等[8]報(bào)道的結(jié)果相比，檢出率有所減低，復(fù)合侵染情況也明顯減少，雖然當(dāng)前云南省種薯質(zhì)量較2005年前得到了明顯改善，但整個(gè)現(xiàn)狀仍然令人堪憂。

本研究發(fā)現(xiàn)，PVS在試管苗和原原種微型薯檢出率均最高，分別檢到了14.60%和26.40%，結(jié)果與范國權(quán)等[9]自2004～2010年對全國馬鈴薯病毒病跟蹤調(diào)查相比發(fā)現(xiàn)，整體病毒檢出率呈下降趨勢，但試管苗中PVS病毒檢出率仍然是最高。高艷玲等[10]對黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、貴州等幾個(gè)馬鈴薯種植大省的試管苗、原原種和大田樣品檢測發(fā)現(xiàn)，檢出率最高的病毒仍然為PVS，檢出率18.94%。PVS檢出率較高，可能與該病毒較難脫除有關(guān)，需要進(jìn)一步研究脫除PVS的脫毒技術(shù)。

昆明地區(qū)的試管苗和微型薯均檢測到了TSWV，TSWV是近年在云南省的番茄、煙草上危害較重的病毒，馬鈴薯是TSWV寄主之一，主要由西花薊馬（Frankliniella occidentalis）傳播[11]，在一些送檢試管苗樣品中以及微型薯實(shí)地調(diào)查觀察到了大量薊馬，從這些樣品中檢測到了TSWV。昆明的1個(gè)樣品檢測到了TRSV。PVA、TSWV、TRSV屬于檢疫性有害生物，應(yīng)防止其傳播擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。PVM僅檢測到一個(gè)樣品，但仍然值得重視。

國標(biāo)（GB 18133-2012）規(guī)定用于馬鈴薯各級別種薯的田間檢測質(zhì)量要求，二級種的總病毒允許率最高為10%，根據(jù)結(jié)果可知云南省試管苗的合格率為75.92%，微型薯為64.89%，與國標(biāo)要求差距較遠(yuǎn)。核心因素是種薯生產(chǎn)體系不規(guī)范，質(zhì)量監(jiān)督檢測體系不健全，種薯生產(chǎn)環(huán)節(jié)與質(zhì)量監(jiān)督檢測嚴(yán)重脫節(jié)。云南省種薯生產(chǎn)單位普遍缺少檢測所需設(shè)備和技術(shù)人員，在種薯生產(chǎn)的整個(gè)過程中沒有按國標(biāo)或地標(biāo)進(jìn)行檢測，長期以往造成普遍認(rèn)為只要通過莖尖剝離即能完成脫毒。近年來云南省通過現(xiàn)代農(nóng)業(yè)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系的建立，在馬鈴薯生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)取得了顯著成效，尤其在提高種薯生產(chǎn)單位檢測意識，提升質(zhì)量檢測技術(shù)部門檢測能力方面得到了明顯改善，對提高云南省脫毒種薯質(zhì)量有積極的意義。

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Virus Detection and Analysis of in vitro Plantlets and Minitubers of Virus-free Seed Potato in Yunnan Province

ZHANG Lizhen, DONG Jiahong*, ZHENG Kuanyu, WU Kuo, SU Xiaoxia, FANG Qi, ZHANG Zhongkai*

( Biotechnology and Germplasm Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Provincial Key Lab of Agricultural Biotechnology, Key Lab of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation, Ministry of Agriculture, Kunming, Yunnan 650223，China )

Abstract:Theviral diseases are important constrains to yield and quality of potato. Invitroplantlets andminitubers are the key steps in the production of virus-free seed potato. In this research, 630 samples including 274 in vitro plantlets and 356 minitubers were collected from 2010 to 2013 in Yunnan Province.The samples were detected through the electron microscopy.DAS-ELISA was used to test PVS, PLRV, PVY, PVX, PVA, PVM, TSWV and TRSV. The results showed that PVS and PLRV were two predominant viruses, and 21.27%and 5.71%of the samples were infected by PVS and PLRV, respectively. TSWV and TRSV were two emerging viruses infecting potato in China. The results could provide a consult for detection and control of potato virus diseases in potato production.

Key Words:in vitro plantlet; minituber; virus-free seed potato; major virus; incidence; analysis

*通信作者（Corresponding author）：董家紅，研究員，主要從事植物病毒學(xué)研究，E-mail: dongjhn@126.com；張仲凱，研究員，主要從事植物病毒學(xué)研究，E-mail: zhongkai99@sina.com。

作者簡介：張麗珍（1968-），女，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事馬鈴薯脫毒及病毒檢測。

基金項(xiàng)目：云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（2013KJTX003）；云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科研所及優(yōu)秀團(tuán)隊(duì)建設(shè)（2014CZYY021）；云南省高層次科技人才培引工程（2011CI134）。

收稿日期：2014-09-21

文章編號：1672－3635（2015）01-0042-04

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

中圖分類號：S532