紅花黃色素對乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR縫隙連接蛋白Cx43的影響 ※

紅花黃色素對乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR縫隙連接蛋白Cx43的影響※

童彩玲楊瑞儀1黃梅陸慧敏

(廣州中醫藥大學第一附屬醫院乳腺科，廣東廣州510405)

【摘要】目的觀察紅花黃色素對乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR縫隙連接蛋白Cx43的影響。方法取對數生長期的MCF-7/ADR細胞，以2×10`5cells/孔接種于6孔培養板，24 h后分為4組，每組3孔，其中3組分別加入紅花黃色素至終濃度25、50、100 mg/L，另一孔設為空白對照組，作用48 h。Western blot法檢測各組MCF-7/ADR細胞中Cx43表達水平。結果不同濃度紅花黃色素作用于MCF-7/ADR細胞48 h后，Cx43表達水平均增高，有明顯的劑量依賴關系，以50、100 mg/L濃度作用顯著(P<0.01)。結論紅花黃色素能提高乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR縫隙連接蛋白Cx43的表達水平。

【關鍵詞】紅花；乳腺腫瘤；連接蛋白43；藥理作用；藥物篩選試驗，抗腫瘤

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2015.05.030

【中圖分類號】R286.91；R737.9；R977.6；R73-354；R285.5

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)05-0725-03

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of Safflower yellow on gap junction protein Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR.MethodsMCF-7/ADR cells of logarithmic growth phase were inoculated in six-well culture dishes (2×10`5 cells each hole)，and divided into 4 groups after 24 hours，3 holes in each group.3 groups were added Safflower yellow to the final concentration of 25，50，100 mg/L，respectively.The last group was blank control group.48 h after cultivating，the expression level of Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR were detected by Western-blot.Results48 h after different concentration of Safflower yellow acted on MCF-7/ADR cells，the expression level of Cx43 was increased in a dose-dependent relationship and there were remarkable effects on the concentration of 50，100 mg/L (P<0.01).ConclusionSafflower yellow can improve the expression level of gap junction protein Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR.

作者簡介：童彩玲(1975—)，女，副主任中醫師，博士。研究方向：中西醫結合治療乳房疾病。

收稿日期：(2014-05-08)

Effects of Safflower yellow on gap junction protein Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADRTONGCailing*，YANGRuiyi，HUANGMei，etal.*DepartmentofGalactophore，theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangdong，Guangzhou510405

【Key words】 Safflower; Breast tumor; Cx43; Pharmacologic action; Drug screening test; Anti-tumor

※項目來源：2012年度廣東省自然科學基金博士啟動項目(編號：S2012040006689)

1廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州510405

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，化療是乳腺癌治療的重要手段，以往對提高化療藥物療效的研究多從逆轉化療藥物的多藥耐藥入手。近年來研究發現，可通過增強腫瘤細胞的縫隙連接(gap junction，GJ)功能，來增強化療藥物的細胞毒性[1]，為腫瘤治療開辟了新途徑。

GJ是細胞間進行物質交換的主要連接通道，由特殊的通道蛋白—連接蛋白(Connexin，Cx)組成。乳腺癌各種細胞株中GJ功能存在不同程度的降低或缺失，提高GJ功能可顯著增強阿霉素對乳腺癌的抗腫瘤作用[2]。本課題組前期研究發現，紅花黃色素能上調心肌連接蛋白Cx43水平，對阿霉素心肌損傷具有一定的心臟保護作用[3]。本實驗研究旨在探討紅花黃色素對乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR縫隙連接蛋白Cx43的影響，結果如下。

1材料與方法

1.1藥物及試劑人乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/ADR(深圳市百恩維生物科技有限公司)；阿霉素(深圳萬樂藥業有限公司，批號1212E1)；紅花黃色素(山西華輝凱德制藥有限公司，批號201302035)。DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)。Cx43兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、β-actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗(美國PTG公司)。Western及免疫沉淀(IP)細胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、一抗二抗去除液(上海碧云天生物科技有限公司)。增強化學發光(ECL)試劑盒(廣州美津生物技術有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養將MCF-7/ADR接種于DMEM高糖培養液，內含10%胎牛血清、100 g/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、1 μg/mL阿霉素，37 ℃、5%CO2培養。2~3 d后細胞融合達到80%~90%時1∶2或1∶3傳代培養。

1.2.2紅花黃色素處理取對數生長期的MCF-7/ADR細胞以2×105cells/孔接種于6孔培養板，24 h后分為4組，每組3孔，其中3組分別加入紅花黃色素至終濃度25、50、100 mg/L，作用48 h另1組設為空白對照組，術進行任何處理。

1.2.3Western blot法檢測Cx43蛋白表達吸去各組細胞培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞2遍后，用Western及IP細胞裂解液充分裂解，離心收集上清液，BCA法測定總蛋白濃度。取相同濃度的蛋白液進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，將分離的蛋白轉到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，加入1∶2 500稀釋的Cx43兔單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入1∶8 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜，與化學發光試劑ECL于暗室中進行反應，待膠片爆光，專業圖像分析顯影定影，掃描圖像，采用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件分析條帶密度。PVDF膜用一抗二抗去除液洗膜去掉抗體，按上述方法重新封閉，加入1∶8 000稀釋的β-actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗進行二次雜交，ECL顯色，掃描圖像，以作為內參對照。

1.3統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行統計學顯著性分析。

2結果

4組人乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/ADR Cx43蛋白表達比較見圖1、2。

圖1　4組人乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/ADR Cx43蛋白表達 注：1為空白對照組；2為紅花黃色素25 mg/L組；3為紅花黃色素50 mg/L組；4為紅花黃色素100 mg/L組

圖2　4組人乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/ADR Cx43蛋白表達比較 與空白對照組比較，** P<0.01

Western blot結果采用Image Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件進行定量分析，灰度值以累積吸光度值表示，結果以Cx43與β-actin的累積吸光度比值表示。由圖1、2可見，不同濃度紅花黃色素作用于MCF-7/ADR細胞48 h后，Cx43蛋白表達水平增高，有明顯的劑量依賴關系，以50、100 mg/L濃度作用顯著(P<0.01)。

3討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，以阿霉素為代表的蒽環類藥物在乳腺癌化療方案中有著舉足輕重的地位。但腫瘤細胞對阿霉素產生的耐藥及其心臟毒性，直接影響了其療效和廣泛使用。臨床研究發現，在阿霉素化療時加用紅花注射液可以預防和減輕阿霉素引起的急性心臟毒性，提高患者對阿霉素化療的耐受性和依從性[4-5]。實驗研究表明，紅花黃素不僅能上調心肌連接蛋白Cx43水平，對阿霉素心肌損傷具有一定的保護作用[3]，而且對腫瘤細胞有較強的抑制作用[6]。

縫隙連接(GJ)是位于細胞膜上的一種特殊細胞連接，生物體內相鄰細胞間主要通過GJ通道互相傳遞信號分子，從而控制細胞間的協調生長。近年來，GJ已成為較為公認的腫瘤抑制基因，GJ介導的細胞間通訊功能可抑制腫瘤的發生和轉移[7]。GJ由特殊的通道蛋白—Cx組成，Cx是進行細胞間通訊的物質基礎，廣泛存在于心臟、肝臟、肌肉和皮膚等。目前在乳腺組織中檢測出Cx26、Cx32和Cx43 3種Cxs表達，其中又以Cx26和Cx43表達為主。有研究發現，在Hela細胞，Cx26/Cx32組成的GJ能增強順鉑的細胞毒性。順鉑能夠通過直接作用于Cx抑制GJ的通透性而降低順鉑的細胞毒性，這可能是其耐藥性產生的一種機制[8]。因此，Cx不失為一種逆轉化療耐藥的治療靶點，尋求能增強乳腺癌細胞Cx43表達的藥物，對提高阿霉素的抗腫瘤作用具有十分重要的意義。紅花黃色素是從活血化瘀中藥紅花中提取的有效成分之一。本研究結果顯示，紅花黃色素能使乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR的縫隙連接蛋白Cx43表達水平增高，且有明顯的劑量依賴關系，為中醫藥在逆轉化療耐藥方面提供了新的研究思路。

參考文獻

[1]齊曉艷，張波，余美玲，等.三七皂苷R1通過細胞縫隙連接對順鉑細胞毒性作用的影響[J].蚌埠醫學院學報，2012，37(2)：134-136，141.

[2]蔣國君，童旭輝，祝曉光，等.在Hs578T乳腺癌細胞由Cx43組成的細胞縫隙連接對阿霉素細胞毒性的影響[J].中國藥理學通報，2012，28(5)：641-647.

[3]童彩玲，劉金元，黃梅，等.紅花黃色素對阿霉素心肌損傷小鼠縫隙連接蛋白的影響[J].廣州中醫藥大學學報，2014，31(2)：272-274，323.

[4]江英強，宋高平，鄭連喜，等.紅花注射液防治阿霉素相關性心臟毒性的臨床研究[J].現代中西醫結合雜志，2010，19(25)：3146-3147.

[5]劉意.紅花黃色素注射液防治阿霉素相關性心臟毒性的臨床觀察[J].中國社區醫師，2008，24 (23):23.

[6]牛旭艷，張前，任玲，等.羥基紅花黃色素A對移植性H22小鼠腫瘤的抑制作用[J].中華中醫藥雜志，2006(增刊)：177-178.

[7]范高福，童旭輝，陶亮.縫隙連接：一個潛在的腫瘤治療新靶點[J].蚌埠醫學院學報，2012，37(2)：234-237.

[8]由天輝.順鉑對細胞縫隙連接的作用與其耐藥性產生關系的研究[D].廣州：中山大學，2007.

(本文編輯：曹志娟)