熒光互補技術在活細胞中研究蛋白質相互作用的應用

王菲

（聊城大學生命科學學院，山東 聊城252000）

蛋白質是構成組織細胞的基本物質，也是機體生長發育、組織更新等生命活動的承擔者。生命活動的執行并不是基于單一蛋白質，蛋白質間復雜的相互作用幾乎介導了所有活細胞中的生命活動。由此可見，研究深入了解PPI 對人類社會的發展具有深遠的意義。

1 蛋白質相互作用（PPI）

蛋白互作的鑒定及蛋白質在代謝中的作用，是蛋白質生化的熱門領域。蛋白質之間的相互作用是由它們接觸點的互補表面決定的，這種相互作用是折疊過程中所涉及的物理化學性質的結果，最終形成同源或異源寡聚體。這些結合位點具有平坦的拓撲結構，接觸界面不均勻，只有少數殘基提供能量，是它們相互作用親和力的關鍵。研究發現，PPI 的結構域多態性較低，特別是與結合相關的殘基。涉及PPI 的保守結構域的一個例子是PDZ(PSD-95、Dlg 和ZO-1 蛋白)，從細菌到人類的進化過程中，這個結構域被保存下來。在相互作用過程中，這些結構域與對應蛋白的羧基末端殘基相互作用。同樣，結構域也可以單獨與其他結構域(如SH3 一樣)相互作用，形成與信號級聯有關的復合物。每種蛋白質都有能力激發幾種PPI，表明蛋白質網絡比基因組序列更復雜，此外，PPI 還具有動態性，同時性和繼時性。利用熒光互補技術在活細胞內研究PPI 更為研究未知蛋白質的功能提供了強有力的工具。

2 BiFC 技術的起源及理論依據

2002 年，Hu 等經實驗研究第一次提出BiFC 的概念。該實驗采用的熒光蛋白是GFP 的突變子增強型黃色熒光蛋白（EYFP），將1 組相互作用的同向平行的Leu 拉鏈與從多個特定位點切開的EYFP 的碳端和氮端融合表達。結果表明，在氨基酸Ala154，Asp155 位切開與Leu 拉鏈共表達的融合蛋白，能夠在活體內發出黃色熒光[1]。若沒有融合蛋白間的相互吸引，單個GFP 片段不具熒光活性。用熒光蛋白構建BiFC 系統的關鍵是在熒光蛋白中找到合適的分割位點。通過對照實驗，找出在蛋白質- 蛋白質相互作用恢復熒光時，能產生最亮的熒光切割處，然后將C 端和N 端與一對互相作用的目標蛋白共表達。當目標蛋白對相互作用時，N 和C 片段緊密相連，開始了片段N和C 之間的空間互補過程。因此，熒光蛋白分子被重構，最終允許在適當的激發波長下發出熒光，BiFC 技術由此建立起來。

3 應用

3.1 熒光互補技術在大腸桿菌中的應用

BiFC 系統建立后，2004 年，Tsuchisaka 等利用BiFC 技術研究9 個1- 氨基環丙烷-1- 羧酸合成酶（ACS）多肽是否可以構成異源二聚體，這些多肽由擬南芥基因組編碼。該研究在大腸桿菌體內融合表達出不同多肽的y92a 和k278a 突變體，并用這些共表達產物進行分子間互補實驗，實驗數據顯示它們可以形成異源二聚體。2007 年，Morell M等研究了蛋白間弱相互作用，采用了BiFC 技術和流式細胞術聯合技術。該實驗的研究對象是富含Pro 多肽p41 和c-Ab1 Tyr 激酶的一個結構域SH3，將黃色熒光蛋白（YFP）在第155 和156 位氨基酸處切割，分別與上述兩個研究對象構建成表達載體p-p41-NYFP 和p-Abl-SH3-CYFP。以單轉為對照，兩個表達載體共轉BL21（DE3）菌株體內。實驗結果表明，單獨的YFP 片段不具熒光活性，而存在共表達的BL21（DE3）內檢測到黃色熒光[2]。

3.2 熒光互補技術在動物活細胞中的應用

雙分子熒光互補在動物細胞內研究PPI 得到廣泛應用。在細胞內蛋白質以特定的形式發揮其生物學功能。細胞內大量的細胞蛋白質是寡聚的，研究蛋白質寡聚為蛋白質功能的研究提供了重要的見解，而BiFC 是實現這一目的有力工具。α- 突觸核蛋白的錯折疊、寡聚和纖維蛋白化是帕金森病（PD）和其他相關神經疾病發生和發展的主要原因。通過在活細胞中應用BiFC，發現α- 核蛋白寡聚體的穩定性會增加細胞毒性，Hsp70可以在減少α- 核蛋白寡聚體形成，來減少細胞毒性。BiFC 在神經退行性疾病的分子基礎研究中的應用能夠直接顯示活細胞中的α- 核蛋白寡聚體及其Hsp70 對其的調節作用，從而成為尋找治療神經疾病的新工具。利用熒光互補系統了解寡聚是如何發生的，對于治療疾病開發新的治療方法至關重要。

3.3 熒光互補技術在植物活細胞中的應用

2003 年，Hu 等人提出了多色熒光蛋白互補技術，該技術的提出離不開BiFC 的基礎。2004 年，Walter 等構建了多種表達載體研究植物蛋白互作[3]，這是首次報道BiFC 技術應用于擬南芥原生質體、煙草葉中。這些蛋白互作分析為BiFC 在不同細胞間隔中高效顯示不同結構蛋白的可行性奠定了基礎。經過發展，多個BiFC 系統運用到植物活細胞中，同時顯示同一細胞內多種蛋白質相互作用。這種方法是基于不同光譜特征的熒光蛋白片段之間的互補。2008 年，Lee 等人的研究發現在煙草BY-2 原生質體、洋蔥表皮細胞中，農桿菌病毒VirE2 與跨膜蛋白-4、擬南芥核轉運蛋白都發生相互作用，不同的是前者互作的場所在細胞核，而后者發生于細胞質中。該結論的發現，是研究者利用了多色BiFC 技術，將Venus 和Cerulean 克隆到CFP 的N 端（nVenus 或nCerulean），靶蛋白克隆到CFP 的C 端，nVenus 和C- 端融合蛋白互作發出黃色熒光，C- 端融合蛋白和nCerulean作用處則呈現了藍色熒光[4]。由此可見，多色BiFC 是一種有效的技術，可以同時確定一個給定的“誘餌”蛋白和多個“獵物”蛋白質在活的植物細胞中的相互作用。多色熒光蛋白互補技術在研究植物信號傳導中也發揮著重要作用，對農業發展有著極大影響。

4 展望

近些年，BiFC 技術在PPI 研究中已經得到普遍應用，且發展迅速，并從多色熒光互補技術產生，到與其它技術如熒光共振能量轉移，流式細胞術的聯用，使其具有更加廣泛的應用前景。