固定化堿性蛋白酶制備麥胚抗氧化肽條件優(yōu)化

吳 定 孫嘉文 黃卉卉 謝惠惠 路桂紅 劉長鵬

固定化堿性蛋白酶制備麥胚抗氧化肽條件優(yōu)化

吳 定 孫嘉文 黃卉卉 謝惠惠 路桂紅 劉長鵬

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院／江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心／江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023）

利用凍干麥胚蛋白粉為原料，篩選影響固定化堿性蛋白酶制備麥胚抗氧化肽工藝條件的因素，并利用影響因素優(yōu)化麥胚抗氧化肽制備工藝。采用Plackett－Burman試驗設(shè)計，篩選出顯著影響因素。利用Box－Behnkeny試驗設(shè)計，顯著影響因素進行響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗。結(jié)果顯示，顯著影響因素從大到小依次為麥胚蛋白懸濁液pH值、酶水解溫度、底物濃度；響應(yīng)面分析試驗得到麥胚抗氧化肽對自由基清除率的回歸方程，方程達到極顯著水平（F＝35.62，P＝0.000 5），擬和很好＝0.964 5，＝0.957）。固定化蛋白酶制備麥胚抗氧化肽優(yōu)化工藝參數(shù)：底物質(zhì)量濃度為4.92 g／100 mL、麥胚蛋白懸濁液的pH為9.2和酶水解溫度為58.5℃；在此條件下，抗氧化肽對自由基的清除率達到55.62%。固定化蛋白酶重復(fù)使用，第18次時抗氧化肽的相對產(chǎn)率達到91.47%。

固定化蛋白酶 麥胚抗氧化肽 因素篩選 工藝優(yōu)化

現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)消化道中的酶作用后，大多是以寡肽的形式被消化吸收的，以游離氨基酸形式吸收的比例很小［1］。

小麥胚芽是小麥粉加工副產(chǎn)品，脫脂麥胚蛋白質(zhì)達到27.8%～30%，遺憾未能得到合理利用［2－9］。麥胚蛋白通過蛋白酶水解和精制，形成的麥胚寡肽不僅更容易消化吸收，而且還具有一定降血壓、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化的功能，因此，開發(fā)具有抗氧化活性的麥胚蛋白肽產(chǎn)品，具有良好的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景［2－12］。

中性蛋白酶AS1.398、Neutrase、堿性蛋白酶Alcalase、堿性蛋白酶ProleatherFG－F、堿性蛋白酶ProteaseS水解等都可用于水解麥胚蛋白制備抗氧化活性肽，然而，堿性蛋白酶Proleather FG－F是制備麥胚抗氧化肽的最適宜水解酶［5－12］。

目前，國內(nèi)采用游離的單酶法或雙酶法對麥胚蛋白水解制備具有抗氧化活性麥胚寡肽［7－13］，而固定化蛋白酶法制備麥胚抗氧化肽鮮見報道。

使用游離酶制備麥胚抗氧化肽存在2點不足：1）每批次必須使用一定量的蛋白酶，蛋白酶不能多次反復(fù)使用，增加生產(chǎn)成本；2）為了控制蛋白酶水解程度，必需對蛋白酶水解進行煮沸處理以滅酶活，操作麻煩。而固定化酶就能克服游離酶的缺點。為此，為了開發(fā)麥胚抗氧化肽制備新途徑，進行了固定化堿性蛋白酶Proleather FG－F制備麥胚抗氧化肽工藝條件的試驗優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 材料

凍干麥胚蛋白粉（純度99%）：南京財經(jīng)大學(xué)糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室；枯草桿菌堿性蛋白酶ProleatherFG－F：阿瑪諾天野酶制劑商貿(mào)（上海）有限公司；固定化堿性蛋白酶ProleatherFGF（簡稱固定化堿性蛋白酶）（酶活力為5 800 U／g，4℃保藏）：南京財經(jīng)大學(xué)發(fā)酵工藝實驗室。

1.2 主要設(shè)備

TGL－16G型高速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；THZ－22型恒溫振蕩機：上海世平實驗設(shè)備有限公司；FD－1B型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化堿性蛋白酶制備麥胚抗氧化肽

稱取一定量凍干麥胚蛋白粉，加100 mL去離子純化水，調(diào)pH，置超聲波振蕩儀，于50℃振蕩25 min。麥胚蛋白懸濁液，熱變性處理15 min，冷卻后加入一定量固定化堿性蛋白酶，再放入超級恒溫水浴器，在一定溫度下水解一定時間。從水解麥胚蛋白液中取出固定化酶，酶水解液于16 000 r／min離心15 min。上清液脫鹽后濃縮，經(jīng)過冷凍干燥，得到麥胚抗氧化肽粉。

1.3.2 Plackett－Burman試驗設(shè)計因子水平

Plackett－Burman（PB）設(shè)計，是一種從多因素中篩選對試驗指標有顯著影響因子的方法。我們在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對麥胚蛋白質(zhì)量（m）與溶劑體積（V）比值（簡稱底物質(zhì)量濃度，g／100 mL）、麥胚蛋白懸濁液pH值（簡稱pH值）、固定化堿性蛋白酶使用質(zhì)量（m）與麥胚蛋白懸濁液體積（V）比值（簡稱固定化酶使用量，%）、固定化堿性蛋白酶水解溫度（簡稱酶水解溫度）、和固定化堿性蛋白酶水解時間（簡稱酶水解時間）和麥胚蛋白懸濁液熱變性溫度（簡稱熱變性溫度）進行Plackett－Burman試驗設(shè)計，確定了PB設(shè)計每個因素的上、下限（表1）。

表1 影響水平試驗設(shè)計

利用design expert 7.1.3軟件，設(shè)計了6個影響因子PB試驗方案。采用清除率作為試驗響應(yīng)值，按照設(shè)計的試驗序號和試驗水平參數(shù)進行試驗。

1.3.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化固定化堿性蛋白酶制備麥胚抗氧化肽設(shè)計

通過PB設(shè)計，篩選出3個影響貢獻大的因素進行響應(yīng)曲面優(yōu)化水平組合試驗（表2）。

表2 響應(yīng)面分析因子水平表

采用design expert 7.1.3軟件中Box－Behnken對底物濃度（X1）、麥胚蛋白懸濁液pH值（X2）和酶水解溫度（X3）進行三因素三水平試驗設(shè)計，采用清除率作為試驗響應(yīng)值，并依照試驗序號參數(shù)進行試驗。

1.3.4 超氧陰離子自由基清除能力的測定

依照文獻［13－15］進行改良。取Tris－HC1緩沖液（0.1 mol／L、pH 8.2）3 mL 和待測樣品35 mg 渦流3 min后預(yù)熱，加入0.1 mL預(yù)熱的鄰苯三酚（80 mmol／L），渦流5 s，在420 nm 下，測3 min 時的吸光值；鄰苯三酚自氧化不加待測樣品，測吸光值（A0）（Tris－HCl緩沖液作空白對照）。清除率計算可依公式：清除率＝［（A0－A）／A0］×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett－Burman試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

影響因子PB試驗設(shè)計方案及其試驗結(jié)果見表3。

表3 Plackett－Burman試驗設(shè)計方案和試驗結(jié)果

2.2 Plackett－Burman試驗中影響因子分析

試驗?zāi)Ｐ偷腇值為142.88、P＜0.000 1，因此，建立的模型影響極顯著。由于試驗誤差導(dǎo)致的變異僅為0.29%。預(yù)測的為0.966 6，而實際的為0.987 2，因此回歸方程具有極高的擬合度。Rsn為信號誤差比，理想的模型中信號誤差比＞4.0，建立的模型信號誤差比為33.493，說明該模型可用于設(shè)計預(yù)測（表4）。

表4 試驗?zāi)Ｐ椭懈饔绊懸蜃臃讲罘治霰?/p>

當P值＜0.05，說明模型中該項影響顯著，試驗建立模型中A、B、D項的P值都小于0.05，其中B項（P＜0.000 1）影響最大，其次是D項（P＝0.000 2）和A項（P＝0.000 6）（表4）。當P 值＞0.10，說明模型中該項影響不顯著，而C、E、F項的P值都大于0.10，所以這些因子對模型影響不顯著（表4）。由此可見，固定化蛋白酶制備麥胚抗氧化肽的影響因子依次排序為：麥胚蛋白懸濁液pH值（B）＞酶水解溫度（D）＞底物濃度（A）。

2.3 固定化堿性蛋白酶制備麥胚抗氧化肽顯著影響因子的優(yōu)化

Box－Behnken試驗設(shè)計及其試驗結(jié)果見表5。

根據(jù)表5試驗結(jié)果，運行響應(yīng)面分析程序?qū)ο蔬M行統(tǒng)計回歸分析，經(jīng)過回歸擬合得到自由基清除率（Y）與3個影響因素回歸方程：

表6 模型可信度分析統(tǒng)計

2.4 麥胚抗氧化肽清除率模型顯著性分析

通過Design－expert分析軟件，對回歸方程模型進行方差分析（表7）。模型具有高度的顯著性（F＝35.62，P＝0.000 5）；相對于純誤差來說，失擬（F＝0.999 7）不顯著（表7）。因此，該模型可以用來試驗預(yù)測。

表7 回歸方程模型各項的方差分析

若P值＜0.05，說明影響因素有顯著影響；若P值＞0.10，表明影響因素無顯著影響。3個影響因素對固定化堿性蛋白酶制備麥胚抗氧化肽工藝模型都有顯著影響，其影響力依次排序：pH值（X2）＞酶水解溫度（X3）＞底物濃度（X1）（表7）。3個因子中兩因子交互作用的無顯著影響。

模型方程逐步回歸，回歸方程存在穩(wěn)定編碼值（－0.08、－0.61、＋0.71），穩(wěn)定點的特征值為穩(wěn)定點的目標點，即固定化堿性蛋白酶制備麥胚抗氧化肽優(yōu)化工藝參數(shù)：底物質(zhì)量濃度為4.92 g／100 mL、pH值為9.2和酶水解溫度為58.6℃。在此條件下，自由基清除率的預(yù)測值為56%。

2.5 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

利用模型回歸方程，作響應(yīng)面曲面圖，如圖1～圖3所示，反映了固定化堿性蛋白酶制備麥胚抗氧化肽工藝中3個主要影響因子對自由基清除率的影響。

圖1 底物濃度和pH值對清除率的影響

圖2 底物濃度和酶水解溫度對清除率的影響

圖3 酶水解溫度和pH值對清除率的影響

圖1 顯示，在酶解溫度55℃條件下，麥胚蛋白懸濁液pH值和底物濃度對自由基清除率的影響。底物濃度一定水平時，pH值在＋1水平，自由基清除率最低；pH值＋1～0水平范圍內(nèi)，隨著pH值降低，自由基清除率快速增加，在0水平時自由基清除率最高；在0～－1水平范圍內(nèi)，隨著pH值降低，自由基清除率又緩慢下降，但－1水平時自由基清除率高于＋1水平。pH值一定水平時，底物濃度在－1～＋1水平范圍內(nèi)，隨底物濃度增加，自由基清除率先極緩慢的增加，然后又極緩慢下降；只是在0.5～1的水平范圍內(nèi)，隨底物濃度增加，自由基清除率下降程度略有增加。

圖2顯示，在麥胚蛋白懸濁液pH9.5條件下，酶水解溫度和底物濃度對自由基清除率的影響。底物濃度一定水平時，酶水解溫度在－1～＋1水平范圍內(nèi)，隨著酶水解溫度增加，自由基清除率幾乎呈直線增加，在－1水平自由基清除率最低，而＋1水平時自由基清除率最高。酶水解溫度一定水平時，在底物濃度在－1～0水平范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增加，自由基清除率緩慢增加；在0水平時，自由基清除率最高；在0～＋1水平范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增加，自由基清除率較快速下降；－1水平時自由基清除率比＋1水平要高。

圖3顯示，在底物質(zhì)量濃度5g／100mL條件下，酶水解溫度和麥胚蛋白懸濁液pH對自由基清除率影響。麥胚蛋白懸濁液pH一定水平時，酶水解溫度在－1～＋1水平范圍內(nèi)，隨酶水解溫度增加，自由基清除率直線增加，在酶解溫度－1水平時，自由基清除率最低，而＋1水平時自由基清除率達到最大值。酶水解溫度一定水平時，麥胚蛋白懸濁液pH值在－1～－0.5水平范圍內(nèi)，隨pH值得增加，自由基清除率較快速增加；在－0.5～0水平范圍內(nèi)，自由基清除率達最大水平；在0～＋1水平范圍內(nèi)，隨pH值增加，自由基清除率快速下降；在＋1水平時，自由基清除率緩最低。

2.6 優(yōu)化工藝驗證試驗和固定化蛋白酶重復(fù)使用

按照試驗優(yōu)化工藝參數(shù)，共進行10批次樣本平行試驗，平均自由基清除率達到55.62%，與預(yù)測得率56%有很好吻合度。固定化蛋白酶重復(fù)使用，第18批次時抗氧化肽相對產(chǎn)率達到91.47%。

3 結(jié)論

采用PB試驗及其影響因素方差分析，固定化蛋白酶制備麥胚抗氧化肽的影響因子依次排序為：麥胚蛋白懸濁液pH值（B）＞酶水解溫度（D）＞底物濃度（A）。而固定化酶使用量、酶水解時間和熱變性溫度的影響不顯著。

采用麥胚蛋白懸濁液pH值、酶水解溫度和底物濃度進行響應(yīng)面分析試驗，得到麥胚抗氧化肽對自由基清除率的回歸方程：Y＝54.87667－0.65875X1－2.4225X2＋1.31125X3－0.00025X1X2＋0.06X1X3＋0.00025－0.89583－0.303833－0.39083。模型方程達到極顯著水平（F＝35.62，P＝0.0005），且擬和很好（R2Pred＝0.9645，R2Adj＝0.957），在試驗設(shè)計范圍內(nèi)可以對固定化蛋白酶制備麥胚抗氧化肽清除自由基的清除率進行有效預(yù)測。

通過方差分析顯示，蛋白懸濁液pH值、酶水解溫度和底物濃度對固定化蛋白酶制備麥胚抗氧化肽工藝有顯著影響。

通過對模型方程逐步回歸，得到固定化蛋白酶制備麥胚抗氧化肽優(yōu)化工藝參數(shù)：底物質(zhì)量濃度為4.92g／100mL、pH值為9.2和酶水解溫度為58.6℃。在此條件下，抗氧化肽對自由基的清除率達到55.62%。

固定化蛋白酶重復(fù)使用，第18批次時抗氧化肽相對產(chǎn)率達到91.47%。

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Optimization on Preparation Conditions of Wheat Germ Antioxidant Peptides with Immobilized Alkaline Protease

Wu Ding Sun Jiawen Huang Huihui Xie Huihui Lu Guihong Liu Changpeng
（College of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance ＆ Economics／Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety／Key Laboratory of Universities in Jiangsu of Grains and Oils Quality Safety Control and Deep Processing，Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210023）

The effect factor on preparation conditions of wheat germ antioxidant peptides with immobilized alkaline protease was screened based on using freeze－drying wheat germ dried white as raw materials and the preparation process of wheat germ antioxidant peptides was optimized by making use of effect factors.The significant influence factors were screened in the experiment design of Plackett－Burman.The optimization experimentation was done to significant influence factors based on experiment design of Box－Behnken.The results showed that effect of suspension pH value of wheat germ protein was greater than that of the enzyme hydrolysis temperature and the concentration of substrate，and the effect of substrate concentration was the minimum during three influence factors.The regression equation on the clearance rate of wheat germ antioxidant peptides for free radical was obtained by the response surface analysis test，and equation reached extremely significant level（F ＝ 35.62，P ＝ 0.000 5）with good fitting（＝0.964 5，＝0.957）.The optimization process parameters of wheat germ antioxidant peptides with immobilized alkaline protease were showed as follow：the concentration of substrate of 4.92%，wheat germ protein suspension pH value of 9.2，and enzyme hydrolysis temperature of 58.5℃，on this condition the clearance rate of wheat germ antioxidant peptides for free radical reached 55.62%.The relative yield of wheat germ antioxidant peptides was 91.47%at eighteenth of repeated use of the immobilized alkaline protease.

immobilized alkaline protease，wheat germ antioxidant peptides，factor screening，process optimization

TS210.9

A

1003－0174（2016）07－0114－06

江蘇省教育廳高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)（JHB04－003）

2014－11－31

吳定，男，1962年出生，教授，食品生物工程