二氧化氯對幾種主要真菌毒素的降解效果研究

常曉嬌 王 峻 孫長坡 劉虎軍 伍松陵 孫 晶 吳子丹

二氧化氯對幾種主要真菌毒素的降解效果研究

常曉嬌1，2王 峻2孫長坡2劉虎軍2伍松陵2孫 晶2吳子丹2

（河南工業大學糧油食品學院1，鄭州 450001）
（國家糧食局科學研究院2，北京 100037）

研究了不同濃度的ClO2對黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、嘔吐毒素（DON）和伏馬毒素B1（FB1）4種主要真菌毒素的降解作用，結合糧食加工工藝及ClO2的使用狀態，評價了其在液體和氣體2種狀態下對玉米粉及其副產物中ZEN的降解效果。結果表明，500 mg／L ClO2對10μg AFB1、25μg ZEN、25μg FB1處理24 h，降解率分別為100%、100%、66%，而對DON無降解效果。對污染玉米及其副產物中ZEN的降解能力進一步研究，結果表明，pH值為中性的玉米粉樣品，采用液體浸泡的方法降解效果更好，300 mg／L的ClO2處理5 h即可把ZEN的含量從7 073μg／kg降至495μg／kg；而對于pH值為4、ZEN含量為7 646μg／kg的燃料乙醇生產過程中產生的廢醪樣品，處理20 h的ZEN降解率為57%。

二氧化氯 真菌毒素 降解 玉米副產物 化學脫毒

真菌毒素是由多種產毒真菌在糧食的種植、收獲、運輸、儲存過程中侵染并產生的次生代謝產物［1］。在我國，常見的真菌毒素主要有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮（ZEN）、嘔吐毒素（DON）、伏馬毒素等，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性最高，而伏馬毒素B1（FB1）是伏馬毒素的主要組分。這些真菌毒素廣泛存在于玉米、大麥、小麥、花生、乳制品等食品及飼料中［2］，對人畜健康造成了巨大的威脅［3-4］，也對我國的對外貿易、畜牧養殖等造成了極大的經濟損失［5-6］。

目前，針對真菌毒素脫毒開發的方法主要分為物理方法、化學方法和生物方法，傳統的化學方法不但效果不理想，在安全性上往往也存在著一定的弊端［7］。二氧化氯（ClO2）作為被WHO、FDA 等組織公認安全、無毒的綠色消毒劑，具有氧化性強、殺菌能力好等特點，已經廣泛應用于自來水消毒［8-9］、空氣殺菌［10］、水產和禽畜養殖［11］及醫療［12］等領域。研究表明，ClO2對黃曲霉毒素有很好的脫毒效果，如李建輝等［13］用10 g／L 的ClO2溶液，以5∶1 的料液比（mL／g）浸泡黃曲霉毒素污染花生，處理后黃曲霉毒素含量小于20μg／kg，但至今鮮見ClO2對伏馬毒素及玉米中ZEN的脫毒研究報道。

本研究利用ClO2的強氧化能力，測定其對3種真菌毒素標準品的降解效果，并分別以ClO2氣體熏蒸和液體浸泡的方式處理ZEN污染玉米粉及其副產物，探究糧食及其副產物中ZEN的ClO2處理方式和使用濃度，以期為真菌毒素污染糧食及飼料的化學脫毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

供試真菌毒素標準品：北京泰樂祺科技有限公司；玉米粉及玉米副產物：某玉米深加工企業；ClO2消毒液：深圳市羅奇環?？萍加邢薰?；玉米赤霉烯酮免疫親和柱：北京中檢維康生物技術有限公司；XBridgeR C18液相色譜柱：沃特世科技（上海）有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：天津博納艾杰爾科技有限公司。

希潔ClO2發生器（XJ-02型-1）：深圳市羅奇環?？萍加邢薰?；冷凍干燥機：美國Labconco公司；Infors HT搖床：伊弗森生物技術（中國）有限公司；實驗室高剪切乳化機（MX021 MXR系列）：上海沐軒實業有限公司；高效液相系統（Waters 2695）：美國沃特世（Waters）科技有限公司；Agilent 6510 Q-TOF LC／MS：美國安捷倫科技公司。

1.2 研究方法

1.2.1 ClO2對真菌毒素標準品的降解效果

將ClO2發生器與容積為500 L、密閉性良好的玻璃容器相連，同時設置1根與進氣管相同的排氣管，將容器內多余氣體排入大氣中，以保證在發生器穩定工作過程中容器內部氣體壓力和ClO2濃度恒定不變。

分別取一定量的AFB1、ZEN、DON和FB1標準品溶液置于離心管中，離心干燥，使管中毒素含量分別為10、25、25、25 μg，備用。

將ClO2發生器轉數調至2 r／h，使其和容器連接并穩定工作1 h，此時容器內的ClO2氣體濃度為100

mg／L。分別將提前制好的3種毒素管若干支放入容器中，離心管開口遠離進氣口，并立刻蓋好容器，待反應分別進行至不同時間取樣待測。

將ClO2發生器轉數調至11 r／h，穩定工作1 h后，容器內的ClO2氣體濃度為500 mg／L，毒素管放置和取樣方法不變。

將樣品復溶于1 mL無水乙醇中，待高效液相色譜（HPLC）檢測。

1.2.2 ClO2對玉米及其副產物中ZEN的降解效果評價

待處理樣品為玉米粉、酒糟蛋白（DDGS，用于熏蒸法）、廢醪（用于浸泡法）、玉米副產物混合物，其中玉米粉pH值為偏中性，DDGS和廢醪pH值為4左右，玉米副產物混合物由玉米深加工過程中產生的副產物按一定比例混合烘干而成，主要包括玉米皮、玉米漿、玉米粕、粗蛋白、糖渣等，pH值為5左右。每個處理取玉米粉或玉米副產物干基10 g，每個處理設3個重復。

由于ClO2主要以氣體和液體2種狀態使用，因此，該部分研究分別采用2種方法處理：1）氣體熏蒸法：將ClO2發生器調至2 r／h，待穩定后分別放入待測的玉米粉、DDGS、副產物混合物，均勻平鋪在直徑為12 cm的定性濾紙表面，并于處理不同時間取樣，烘干待測。2）液體浸泡法：取待處理的玉米粉及玉米副產物混合物樣品若干份，向其中加入適當無菌蒸餾水至一定體積，以500 mg／L的ClO2濃液體為原液，取適當量加入裝有水的待測樣品中，使處理終濃度分別為50、100、300 mg／L，終體積300 mL（具體添加量如表1所示）。迅速轉移至500 mL搖瓶中，于30℃，100 r／min恒溫培養，不同時間取樣，烘干待測。

表1 液體浸泡法處理玉米及其副產物ClO2添加量

準確稱取5 g經研磨的烘干樣品，加入1 g NaCl置于燒杯中，加入50 mL 乙腈／水＝90／10（V／V），3 000 r／min乳化3 min，收集濾液，并將其用蒸餾水稀釋5倍，取10 mL稀釋后的萃取液過ZEN免疫親和柱，最后用1 mL無水甲醇洗脫于液相瓶中待HPLC檢測。

1.2.3 高效液相色譜檢測條件

AFB1檢測條件：參照GB／T 18979—2003［14］；ZEN 檢測條件：參照GB／T 23504—2009［15］；DON 檢測條件：參照GB／T 23503—2009［16］；FB1檢測條件：參照GB／T 25228—2010［17］。

1.2.4 ZEN降解產物的初步鑒定

分別對ClO2氣體熏蒸ZEN標準品12 h和24 h樣品進行質譜分析。

色譜柱Agilent poreshell 120 EC-C18，2.1×100 mm；液相系統流速0.3 mL／min；柱溫40 ℃；上樣量3μL；流動相A：H2O＋0.1% 甲酸＋5 mM NH4Ac；B：甲醇＋0.1%甲酸。流動相比例如表2所示。

表2 流動相的洗脫比例／%

2 結果與討論

2.1 ClO2對幾種真菌毒素的降解效果

分別用2種不同濃度的ClO2氣體處理4種真菌毒素標準品的結果顯示，ClO2對AFB1、ZEN、FB1均有降解效果，并且隨著濃度的增加和時間的延長，降解效果隨之提高。如圖1a所示，濃度為100 mg／L熏蒸含量為10μg的AFB1毒素管，處理1 h時降解曲線斜率最大，之后逐漸變小，在處理24 h時降解效果達到89%，40 h時無檢出。而在500 mg／L的ClO2氣體處理過程中6 h即無檢出，說明ClO2與AFB1迅速反應，使其在短時間內被降解。

對ZEN的試驗過程中（圖1b），2種濃度ClO2氣體處理效果差異顯著，500 mg／L的ClO2熏蒸0.5 h即可使ZEN降解5.75μg，而100 mg／L濃度處理40 h，被降解的ZEN也只有8μg。說明ClO2與真菌毒素的反應是瞬時的，當達到一定濃度時，其在短時間內就可使大量真菌毒素分解，并且能夠看出，與提高ClO2使用濃度增加降解效果相比，進一步延長處理時間雖能使降解作用效果在一定程度上有所提高，但降解效果并不顯著。

500 mg／L ClO2對DON處理40 h，處理后樣品峰形與對照完全重合，說明ClO2在此條件下對DON無降解效果。

圖2為濃度為500 mg／L的ClO2對FB1的熏蒸效果，可以看出，在處理48 h時，25μg的FB1降解率為81%，而使用較低濃度100 mg／L熏蒸的降解效果較低，48 h時僅為8%。

綜上，ClO2在較高濃度下可以與AFB1、ZEN、FB1發生瞬時反應，并隨著處理時間的延長，反應效果會有一定的提高。其中，對AFB1和ZEN的降解效果最為顯著，而對FB1的效果相對差些，對DON無降解效果。

圖1 ClO2對AFB1和ZEN的降解效果

圖2 ClO2濃度為500 mg／L對FB1的降解效果

2.2 ClO2氣體熏蒸法對玉米粉及副產物的降解效果

由于發生裝置在制備大量、高濃度ClO2氣體時尚存在技術瓶頸，而在儲存、使用過程中也存在安全隱患以及高能耗的問題，因此，針對玉米及其副產物中的ZEN污染現狀，本研究選用濃度為100 mg／L的ClO2氣體熏蒸ZEN超標玉米及其副產物。為了增加樣品與ClO2的接觸面積、提高降解效果，試驗中的樣品均被粉碎成粉末，分別熏蒸至6.5、48、72 h取樣、過親和柱，并利用HPLC檢測毒素殘留量。

如表3所示，在處理6.5 h時，玉米粉、玉米副產物混合物、DDGS中ZEN的降解率分別為13%、23%和0，而未處理前，三者的ZEN含量分別為7 073、3 187 和7 646 μg／kg，每處理稱取10 g，ZEN總含量遠低于標準品試驗中的25μg，這說明ClO2在與ZEN反應的同時，也與樣品中的其他物質反應，增加樣品與ClO2的接觸面積也增加了樣品中有機物與ClO2的反應。延長熏蒸時間，72 h時，3種待處理樣品中ZEN 含量分別為495、159、3 746 μg／kg，其中玉米粉和玉米副產物混合物經過處理均降至國家限量標準500μg／kg以下，而對pH值為4的DDGS的處理效果不好。

表3 100 mg／L ClO2對玉米粉及其副產物的熏蒸效果

2.3 ClO2液體浸泡法對玉米粉及副產物的降解效果

待處理樣品分別與不同濃度二氧化氯混合后放置于恒溫搖床中，30 ℃，150 r／min培養5 h，20 h取樣檢測結果表明，經濃度為300 mg／L ClO2浸泡玉米粉5 h后ZEN含量即可降至國家限量標準以下（如圖3a）。但隨著時間的延長，ClO2對ZEN的降解速率降低，并且在pH值為4（如圖3c）的廢醪中明顯比另外2種pH值為5（如圖3b）和pH為中性的樣品中對ZEN的降解效率差。這是因為ClO2在反應初始即迅速消耗、濃度降低，在中性樣品中，ClO2與水分子生成大量氯酸和亞氯酸，提高了其在反應中的氧化性。而在酸性樣品中，氯酸和次氯酸由于溶液中氫離子的大量存在而使可逆反應向解離方向進行，降低了氧化效率，從而降低了ZEN的降解效果。

圖3 不同濃度ClO2液體對玉米粉及其副產物中ZEN的降解效果

2.4 ZEN降解產物的初步分析

HPLC-MS 結果顯示，500 mg／L ClO2處理ZEN標準品12 h后未提取到荷質比為317.139 4的ZEN物質峰（如圖4），對圖4b中“1”位置的可能降解產物峰進一步質譜分析發現，豐度較高的物質分別是荷質比為m／z＝351.129 4和385.093 8，以及分子質量較小的206.989 1（如圖5a）。推測可能是氯原子與ZEN中苯環發生了取代反應，或在共軛烯烴位置發生了加成反應，從而產生了上述幾種新物質。而在24 h處理后的樣品中，只在14.741 min時檢測到較高豐度的物質（如圖4c），其荷質比為m／z＝283.266 1（如圖5b）。說明隨著時間的延長和ClO2的及時補充，ClO2不斷與ZEN發生多步氧化反應，從而產生多個中間產物。這與Stewart DJ等［18］在ClO2充足的情況下，會與色氨酸發生多步氧化反應的結論一致。因此，在ClO2處理的產物中應該包括由碳、氫、氧、氯組成的有機物及一些小分子物質，而產物的具體結構和種類，以及降解機理還需要結合核磁共振等手段進一步探究和解析。

圖4 經500 mg／L ClO2處理ZEN離子流圖

圖5 ZEN降解產物液質聯用分析

3 結論

在保證ClO2濃度恒定的前提下，ClO2可通過瞬時的化學反應降解AFB1、ZEN、FB1，并且在該氧化還原反應中，ClO2的濃度是反應的重要限速因素。另外，為確定降解產物的安全性，還需要對反應產物的結構和毒性做進一步深入解析。

對玉米粉及其副產物中ZEN開展的降解試驗中發現，在使用相同ClO2濃度的條件下，液體浸泡法比氣體熏蒸法效果更為顯著，其中對中性樣品的降解效果較酸性樣品好。在ClO2對ZEN的降解過程中可能發生苯環取代和共軛烯烴的加成反應，產生了含氯的有機化合物及幾種小分子物質，產物的具體結構和降解機理需要進一步的研究確定。

由于ClO2具有強氧化性，但缺乏專一性的特點，可與自然界中絕大多數物質反應，因此，試驗中ClO2除了可與真菌毒素反應，也能與玉米及其副產物中的有機物質反應，在不繼續補充ClO2的前提下，隨著反應物的不斷消耗，ZEN的降解效率逐漸降低，直至停止，同時也可能造成玉米及其副產物中營養成分的損失。在此過程中生成物質的毒性和營養物質的損失情況還需進一步深入分析。另外，在實際生產中由于ClO2的強氧化性還可能對設備或設施造成腐蝕，以及使用高濃度的ClO2氣體易燃爆的特點，因此ClO2在實際生產中的應用條件等還需要進一步的研究。

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Research on Degradation of Chlorine Dioxide in Primary Mycotoxins

Chang Xiaojiao1，2Wang Jun2Sun Changpo2Liu Hujun2Wu Songling2Sun Jing2Wu Zidan2
（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology1，Zhengzhou 450001）
（Academy of State Administration of Grain2，Beijing 100037）

This paper studies the degradation of chlorine dioxide of different concentrations in four primary mycotoxins such as aflatoxin B1（AFB1），zearalenone （ZEN），deoxynivalenol（DON）and fumonisins B1（FB1）.and evaluates the degradation of chlorine dioxide under liquid and gas state in ZEN in maize flour and its byproducts with combination of food processing technology and chlorine dioxide application conditions.The results show that except for no degradation in DON，the degradation rates of 10μg AFB1，25μg ZEN，25μg FB1treated by chlorine dioxide of 500 mg／L for 24 h were 100%，100%，66%，respectively.The results of further research on the degradation in ZEN in polutted corn and its byproducts show that the chlorine dioxide liquid immersion method to deal with the maize flour sample with neutral PH works better，the level of ZEN degraded from 7 073 μg／kg to 495 μg／kg when treated for 5 h by chlorine dioxide at the concentration of 300 mg／L.However，for waste mash sample treated for 20 h and generated during production of the fuel ethanol whose pH value is 4 and ZEN content was 7 646 μg／kg，ZEN degradation rate was 57%.

chlorine dioxide，mycotoxin，degradation，maize byproducts，chemical detoxification

S513

A

1003-0174（2016）09-0113-06

時間：2016-08-10 17：20：21

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／11.2864.TS.20160810.1720.004.html

國家科技支撐計劃（2015BAK43B02），糧食公益性行業科研專項（201513006）

2015-11-12

常曉嬌，女，1984年出生，博士，糧油微生物與質量安全

吳子丹，男，1955年出生，研究員，糧油儲藏