飼料氧化魚油對草魚（Ctenopharyngodon idellus）腸道谷胱甘肽／谷胱甘肽轉移酶通路基因表達活性的影響

林秀秀 葉元土 蔡春芳 吳 萍 黃雨薇 陳科全 彭 侃 徐登輝 羅其剛

飼料氧化魚油對草魚（Ctenopharyngodon idellus）腸道谷胱甘肽／谷胱甘肽轉移酶通路基因表達活性的影響

林秀秀 葉元土 蔡春芳 吳 萍 黃雨薇 陳科全 彭 侃 徐登輝 羅其剛

（蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，蘇州 215123）

為了研究飼料氧化魚油對草魚腸道抗氧化防御能力的影響，以谷胱甘肽／谷胱甘肽轉移酶（GSH／GSTs）通路為研究對象，以豆油、魚油、氧化魚油為飼料脂肪源分別設計豆油組（6S）、魚油組（6F）、2%氧化魚油（2OF）、4%氧化魚油（4OF）及6%氧化魚油（6OF）5組等氮、等能半純化飼料，在池塘網箱養殖草魚［平均體重（74.8±1）g］72 d。采用熒光定量PCR（RT-QPCR）的方法，測定了草魚腸道組織中谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞（GCLC）、谷胱甘肽合成酶（GSS）和谷胱甘肽還原酶（GSR）以及谷胱甘肽S-轉移酶的ω1（GSTω1）、PI-谷胱甘肽S-轉移酶（GSTPI）和微粒體谷胱甘肽S-轉移酶1（MGSt1）的表達活性，并測定了腸道中谷胱甘肽GSH的含量。結果顯示，2OF、4OF和6OF組草魚腸道中GSH／GSTs通路基因表達均上調，其中6F組中MSGT1在腸道中表達顯著上調（P＜0.05），4OF組中GSR和MGST1在腸道中表達顯著上調（P＜0.05），6OF中GCLC和MGST1在草魚腸道中表達顯著上調（P＜0.05）；GCLC表達活性與飼料中MDA含量呈多項式的關系，MGST1表達活性與飼料中AV和（EPA＋DHA）呈多項式關系。結果表明，氧化魚油使草魚腸道GSH／GSTs通路基因表達活性上調，且GSH／GSTs通路基因表達活性對不同濃度氧化魚油所引起的腸道氧化損傷具有不同的應對方式。

草魚 腸道 氧化魚油 谷胱甘肽 基因

脂類在水產動物中具有重要的生理作用［1］。魚油因富含高不飽和脂肪酸是魚類重要的油脂原料［2］。然而，魚油氧化酸敗能產生多種氧化產物，會破壞動物腸道組織細胞，損害動物生產性能及影響動物抗氧化能力［3］。因此，飼料中的魚油對于養殖動物的作用具有二重性：一方面提供動物所需的高不飽和脂肪酸（必需脂肪酸）的營養作用；另一方面，由于氧化酸敗而提供對魚體健康具有損傷作用的氧化產物，其損傷程度與氧化產物種類、含量有直接的關系。

GSH／GSTs是動物重要的解毒、抗氧化系統［4］，劉進［5］通過還原型GSH結合三聯療法治療十二指腸球部潰瘍，提高潰瘍愈合質量。已證實了GSH具有調節仔豬和黃羽肉雞的抗氧化能力［6］，并且通過在飼料中添加GSH能提高草魚、羅非魚的生長性能以及機體自身的抗氧化能力［7-9］。GST是啟動GSH結合反應的關鍵酶［10］，它能夠催化還原谷胱甘肽的硫醇基團與各種親電化合物相結合，增加內源和外源有毒物質的可溶性而利于其排出體外。然而有關GSH／GSTs功能系統在水產動物中的報道非常有限。本研究采用熒光定量PCR技術，測定了草魚攝食含有氧化魚油飼料后腸道中GSH／GSTs通路基因表達活性，以揭示飼料氧化魚油飼料對草魚腸道免疫防御能力的影響。

1 材料與方法

1.1 飼料的制備

氧化魚油來源及制備：豆油為“福臨門”牌一級大豆油，魚油來源于廣東省良種引進服務公司生產的“高美牌”精煉魚油，氧化魚油為魚油在實驗室條件下氧化制備［11］。分別測定了3種油脂過氧化值（POV）、酸價（AV）和丙二醛（MDA）含量，并計算（飼料中POV、AV、MDA尚無有效監測方法），試驗飼料中POV、AV、MDA值分別見表1。

飼料配制：以酪蛋白和秘魯蒸汽魚粉為主要蛋白源，采用等氮、等能方案設計基礎飼料，設置了6%豆油組（簡稱6S組）、6%魚油組（6F）、2%氧化魚油＋4%豆油組（2OF）、4%氧化魚油＋2%豆油組（4OF）、6%氧化魚油組（6OF）作為脂肪源配制5組等氮等能的試驗飼料。飼料組成成分見表2。各組蛋白質量分數為29.52%～30.55%，無顯著差異；各組能量為19.943 ～20.860 kJ／g，無顯著差異。

表1 試驗飼料中POV值、AV值和MDA含量

表2 試驗飼料組成及營養水平（干物質基礎）

1.2 試驗魚與飼養管理

草魚來源于浙江一星飼料有限公司養殖基地，為池塘培育的1冬齡魚種共350尾，平均體重為（74.8±1）g。草魚隨機分為5組，每組設3重復，每重復20尾。

養殖試驗在浙江一星飼料集團試驗基地進行，在面積為5×667 m2（平均水深1.8 m）池塘中設置網箱，網箱規格為1.0 m×1.5 m×2.0 m。將各組試驗草魚隨機分配在5組、15個網箱中。

分別用商品飼料訓化1周后，開始正式投喂。每天08：00和15：00定時投喂，投飼率為2%～4%。每10 d依據投飼量估算魚體增重并調整投喂率，記錄每天投飼量。正式試驗共養殖72 d。

每周用試劑盒測定水質1次，試驗期間溶解氧質量濃度＞8.0 mg／L，pH 7.08 ～8.4，氨氮質量濃度＜0.2 mg／L，亞硝酸鹽質量濃度＜0.01 mg／L，硫化物質量濃度＜0.05 mg／L。養殖期間水溫25～33℃

1.3 樣本采集與分析

1.3.1 樣本采集

養殖72 d、停食24 h后，每網箱隨機取3尾、每組共9尾作為基因分析樣本試驗魚。魚體表面經75%酒精消毒，常規解剖，快速取出內臟團，在冰浴中取出腸道，剪取中腸的前四分之一腸段，用PBS漂洗2～3次，一式2份，迅速裝于EP管中，液氮速凍，于-80℃保存備用。采樣所用剪刀鑷子均經滅酶滅菌處理。

按上述方法，每網箱隨機另取3尾魚腸部分腸段，用于GSH含量測定。

1.3.2 GSH含量測定

腸道組織勻漿后，2 000 r／min離心15 min，取上清液用于GSH含量的測定。GSH測定用GSH試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。

1.3.3 引物設計

基因序列依據葉元土等［12］基因測序結果，定量PCR 中GCLC、GSS、GSR、GSTω1、GSTPI和MGST1 基因及內參基因β-actin所使用的Taqman引物由prime5.0軟件設計，引物序列見表3。

表3 定量PCR引物

1.3.4 總RNA的提取和反轉錄CDNA

利用1.3.1所采集的單個網箱3尾草魚腸段樣本，分別取3個腸段樣本各25 mg合并為一個樣本用于總RNA提取，每組共3個平行樣本（共9尾魚、3個測定樣本）。加入液氮，研磨成粉末后，加入1 mL Trizol覆蓋粉末，待Trizol解凍成液體后全部轉移到1.5 mL的EP管中，按照Trizol方法提取不同組織的總RNA。按照PrimeScriptTMRT Mastetr Mix（TaKaRa公司）反轉錄試劑盒的方法將RNA轉錄成CDNA，將反轉錄產物稀釋后于-20℃保存備用。

1.3.5 定量PCR

使用CFX96熒光定量PCR儀和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa公司）熒光染料對草魚谷胱甘肽通路的相關基因（GCLC、GSS、GSR、GSTω1、GSTPI和MGST1）及β-actin進行熒光定量分析。反應體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ （TaKaRa）10μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，滅菌水6 μL。PCR反應采用兩步法，反應條件為：95℃預變性30 s、95℃變性5 s、60℃ 退火30 s，共40個循環，最后進行溶解曲線（Melting Curve）分析。

1.4 數據處理

公式：2-△△CT＝ 2-（Ct目的基因-Ct管家基因），以β -actin為內參基因根據計算公式得到相對表達量。用SPSS 18.0統計分析軟件進行分析，組間差異顯著性用One-way ANOVA進行統計分析，結果以平均值±標準誤（mean±SD）表示。

2 結果

2.1 飼料氧化魚油使腸道谷胱甘肽含量顯著增加

養殖72 d后，采用試劑盒測定了不同試驗組草魚腸道組織中谷胱甘肽含量，結果如圖1所示。與6S相比，其他試驗組腸道組織中谷胱甘肽含量均顯著上升（P ＜0.05）。

圖1 草魚腸道組織GSH的含量

2.2 飼料氧化魚油影響了草魚腸道谷胱甘肽合成酶基因表達活性

采用熒光定量RT-PCR的方法檢測了催化以谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）為原料合成谷胱甘肽的GCLC、GSS基因，以及催化GSSG還原為GSH的GSR基因的表達活性，結果如圖2所示。

圖2 不同飼料組中草魚腸道谷胱甘肽合成酶基因的表達量

與6S組比較，GCLC除在6F組草魚腸道中表達有所下調外，在2OF、4OF和6OF組中表達均上調，其中在6OF組中顯著上調（P＜0.05）。GSS除在6F組草魚腸道中表達有所下調外，在2OF、4OF和6OF組中表達均上調，但均無顯著差異。GSR除在2OF組草魚腸道中表達有所下調外，在6F、4OF和6OF組中表達均上調，其中4OF組中顯著上調（P＜0.05）。

隨著飼料中氧化魚油添加量的逐漸增加，GCLC在2OF與4OF組腸道中表達無顯著差異，但6OF組腸道中顯著上調（P＜0.05）。GSS在2OF、4OF和6OF組腸道中表達均無顯著差。GSR在2OF和4OF組在腸道中無明顯差異，但在4OF組腸道中顯著上調（P ＜0.05）。

2.3 飼料氧化魚油影響了草魚腸道谷胱甘肽轉移酶基因的表達活性

采用熒光定量RT-QPCR的方法檢測了GSTω1、GSTPI及MGST1 3種谷胱甘肽轉移酶基因的表達活性，結果如圖3所示。

圖3 不同飼料組中草魚腸道GSTs的表達量

以6S組為對照，GSTω1除在6F組草魚腸道中表達有所下調外，在2OF、4OF和6OF組中表達均上調，但無顯著差異。GSTPI在6F、2OF、4OF和6OF組草魚腸道中表達均上調，但無顯著差異。MGST1在6F、2OF、4OF和6OF組草魚腸道中表達均顯著上調（P＜0.05）。

隨著飼料中氧化魚油添加量的逐漸增加，GSTω1及GSTPI基因表達量隨之下調，但均無顯著差；MGST基因表達量隨之上調，但均無顯著差異。

2.4 GSH／GSTs通路相關基因表達活性與飼料油脂氧化產物和EPA、DHA含量的相關性

將各組飼料中的MDA、POV、AV和（EPA＋DHA）的含量與GSH／GSTs通路中的相關基因GCLC、GSS、GSR、GSTω1、GSTPI和MGST1 在腸道中的相對表達量做Pearson相關性分析，檢驗雙側顯著性，結果見表4。

表4 GSH／GSTs通路相關基因表達活性與飼料中MDA、POV、AV和（EPA＋DHA）相關性

由表4可知，飼料魚油氧化產物中MDA含量對GCLC在腸道中的相對表達量影響最大，相關系數為0.77；而營養物質EPA＋DHA的含量對其表達量影響很小，相關系數為0.07。MGST1在腸道中的相對表達量主要受到飼料AV及（EPA＋DHA）的共同影響。AV與MGST1的相關系數為0.92，且表現極顯著（P＜0.01）。EPA＋DHA與MGST1的相關系數為0.97，且表現極顯著（P ＜0.01）。

再對相關系數R2＞0.70的因子作回歸分析如圖4所示，GCLC的相對表達量與MDA值呈二項式關系，隨著飼料中MDA含量的增加，草魚腸道中GCLC的相對表達量先降低后增加。且GCLC相比6S組的表達量變化率為-11.9%～59%。當MDA為10 mg／kg時，GCLC在腸道中的表達量最小。AV值與MGST1的相對表達量呈多項式關系，隨著飼料中的AV含量的增加，草魚腸道中MGST1的相對表達量先增加后下降。當AV為1.28 g／kg時，MGST1在腸道中的表達量達到了最大值。（EPA＋DHA）值與MGST1的相對表達量呈二項式關系，隨著飼料中（EPA＋DHA）含量增加，草魚腸道中MGST1的相對表達量先增加后下降。當（EPA＋DHA）的質量分數為10.3%時，MGST1在腸道中的表達量達到了最大值。且MGST1相比6S組的表達量上升率為74.7%～149.6%。

圖4 MDA、POV、AV 和（EPA ＋DHA）與GSH／GSTs通路相關基因表達量關系

3 討論

3.1 飼料氧化魚油對草魚腸道GSH含量、GSH合成酶基因表達活性有顯著性的影響

飼料氧化魚油促使草魚腸道組織GSH含量顯著增加，以應對油脂氧化中間產物所產生的氧化應激作用。GSH分子中的半胱氨酸殘端有疏基-SH，它是一種強親核性物質，可以通過親核取代和加成作用使有毒親電物質鈍化［13］，這是一種自我損傷修復與保護作用。

還原型GSH在機體內的來源有2條途徑：①合成途徑，以Glu、Cys和Gly等3種氨基酸作為底物在GCLC和GSS的催化下完成。其中，γ-GCL是GSH的合成的限速步驟，而催化該反應的GCLC酶是限制酶；②還原途徑，GSSG在GSR作用及還原性輔酶Ⅱ提供H＋下還原成GSH。小腸可通過是吸收其他器官組織產生的GSH，是主要吸收部位［14］。Vincenzini等［15］、Linder 等［16］分別在兔子、豬的腸道均發現存在GSH的轉運系統，它們通過吸收其他器官組織產生的GSH而使之成為自身的組成部分。本試驗中，6F與2OF組在GSH／GSTs通路中的各個基因表達均無明顯差異。然而，測定草魚腸道中GSH含量時，6F與2OF組草魚腸道的GSH含量卻顯著上升，且6F組的含量高于2OF組。可能是因為這2組魚油氧化產物含量較低，腸道可通過GSH運轉載體吸收從魚體其他器官組織所產生的GSH以應對體內的氧化應激作用。另一方面，4OF組草魚腸道中將GSSG還原為GSH的GSR表達量顯著上調（P＜0.05）。這可能是由于草魚腸道吸收從其他器官中產生的GSH與自由基反應，而形成過多的氧化性GSH（GSSG），促進了GSSG向GSH的轉化。當受到氧化魚油的刺激后，通過上調草魚腸道中GSR的表達量將GSSG還原成GSH，發揮保護腸道的作用。當飼料中脂肪酸氧化產物AV、POV、MDA含量達到一定數量之后（如6OF組），才會刺激GSH的生物合成酶基因的上調表達，以滿足對GSH的需要。如圖4a所示，GCLC的表達與飼料中的MDA呈二項式關系，其表達量隨MDA含量的上升而呈現升高的趨勢。MDA是脂質過氧化物的最終分解產物之一，其含量能直接反映機體脂質過氧化程度［17］。因而，常作為脂類過氧化的測定指標之一。當MDA含量較低時，脂質過氧化程度較低，腸道可通過吸收其他器官的GSH使機體免受氧化損傷。當MDA含量較高、外界GSH不足以滿足魚體應對腸道的氧化損傷，因而促使草魚腸道GCLC表達上調，以3種氨基酸結合生成GSH的方式來提高GSH含量，以抵抗腸道氧化損傷作用，因此GCLC在草魚腸道中與MDA呈二項式關系。

3.2 飼料氧化魚油對草魚腸道谷胱甘肽轉移酶基因的表達有顯著性的影響

本研究涉及GSTs的3種類型，分別為胞液的GSTω1、GSTPi，膜結合酶的MGST1。GSTs 作為一個屬于Ⅱ相代謝解毒酶的同工酶家族，具有清除體內自由基和解毒的雙重功能：一方面，可催化GSH與親電子物質結合而起到解毒作用，最后形成硫醇尿酸經腎臟排出體外；另一方面，具有谷胱甘肽過氧化物酶活力，能防止脂質過氧化損傷［18-19］。但無論哪種作用機制，GST的作用都需要有GSH的參與、是一種依賴GSH發揮解毒、抗氧化作用的酶系，GST在抗氧化系統和解毒代謝中起著十分重要的作用［20］。攝食飼料氧化魚油72 d后，各組草魚腸道GSTs 3種酶的表達都受到了一定的影響。其中腸中MGST1的表達量相比GSTω1、GSTPI上調幅度更大，且MGST1在6F、4OF和6OF組中均顯著上調（P＜0.05）。MGST1作為一種Ⅱ相藥物代謝酶在體內具有上述的雙重功能，MGST1還擔當“感受器”的角色，其具有的半朧氨酸（Cys49）可感受親電子劑等而被修飾并行使對機體的保護作用［21］。可能因為MGST1作為“感受器”的原因，使其比胞漿GSTs更快、更有效的發揮作用，氧化魚油產生多種初級與次級的氧化產物，而這些氧化產物能夠刺激MGST1的“感受器”使其快速反應并且提高自身的催化活性，發揮清除體內自由基和解毒的功能。

如圖4b、圖4c所示，飼料中AV值和（EPA＋DHA）的含量同腸道的MGST1的表達量呈多項式關系，均隨著AV、（EPA＋DHA）含量的增加而呈現出先增加后減少的趨勢。研究發現MGST1的表達量在2OF組中相比于6S組中無顯著差異。這可能是由于飼料中（EPA＋DHA）的營養作用與AV的損傷作用共同影響的結果，2OF的AV增加、但與此同時2OF的（EPA＋DHA）也有所增加。2種共同作用使得腸道中MGST1的表達量與只添加豆油的6S組并無顯著差異。這也顯示了魚油的營養作用、氧化產物損傷作用的雙重性。當AV含量從較少的0.4 g／kg升高到0.77、0.8、1.14 g／kg，（EPA ＋DHA）也從質量分數較少的4.7%升高到6.6%、8.2%、8.5%時腸道中MGST1的表達量顯著升高（P＜0.05）。這可能是由于當飼料中AV值不斷增加即使（EPA＋DHA）也不斷增加，氧化魚油對魚體的損害作用將大于（EPA＋DHA）對魚體的營養作用，導致最后MGST1的表達量不斷增加以應對氧化產物對魚體的氧化損傷。當AV增加1.28 g／kg時，可能出現超出MGST1的作用范圍，其表達量會出現下降，使草魚腸道受到進一步的氧化損傷。因此，飼料中的（EPA＋DHA）的含量對于魚體抗氧化損傷具有一定抵消作用，然而當氧化魚油導致的氧化損傷超出（EPA＋DHA）營養物質的作用范圍，草魚腸道GSH／GSTs基因通路就會發生作用，使魚體免受氧化損傷，但魚油中有害物質過高，魚體自身的抗氧化系統也無法修復，導致魚體健康受到嚴重的損傷。

4 結論

飼料中氧化魚油影響草魚腸道以GSH／GSTs為標志的抗氧化能力，引起GSH／GSTs通路基因的表達活性上調。當飼料中含有較低濃度氧化魚油，草魚腸道通過吸收其他組織的GSH，以及通過還原反應獲得GSH以應對氧化損傷。當飼料中氧化魚油的濃度較高，草魚腸道主要通過以Glu、Cys及Gly為原料合成GSH的方式獲得GSH。MGST1為草魚腸道谷胱甘肽巰基轉移酶中主要的作用類型，受到AV與（EPA＋DHA）共同作用。

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The Effect of Glutathione／Glutathione Transferase Gene Pathway in Intestinal of Grass Carp （Ctenopharyngodon idellus）by Feeding Oxidized Fish Oil

Lin Xiuxiu Ye Yuantu Cai Chunfang Wu Ping Huang Yuwei Chen Kequan Peng Kan Xu Denghui Luo Qigang
（School of Biology＆Basic Medical Science，Soochow University，Suzhou 215123）

The effect of dietary oxidized fish oil on oxidative stress pathway was studied by measuring the intestinal of grass carp GSH／GSTs pathway gene expression.The fish，with an initial weight of（74.8 ±1）g，was fed 72 d with a basal diet and 5 diets added with soybean oil（6S），fish oil（6F），2%oxidized fish oil（2OF），4%oxidized fish oil（4OF）and 6%oxidized fish oil（6OF）.Using RT-QPCR method，determinethe GSH／GSTs pathway gene expression and the GSH content in grass carp intestinal.The results showed that，2OF，4OF and 6OF grass carp intestinal GSH／GSTs gene pathway genes were increased，which 6F group MSGT1 expression was significantly increased （P ＜0.05）in the intestinal，4OF group GSR and MGST1 expression significantly increased （P ＜0.05）in the intestinal，6OF group GCLC and MGST1 expression was significantly increased （P ＜ 0.05）in the intestinal；MDA content in dietary with the relative expression of GCLC was polynomial relations，AV and（EPA＋DHA）content in dietary with the relative expression of GCLC was polynomial relations.In conclusion，oxidized fish oil had an influence on GSH／GSTs gene pathway had the intestinal and when oxidized fish oil different concentrations，GSH／GSTs gene pathway in different ways to deal with.

Grass carp （ctenopharyngodon idellus），intestinal，oxidized fish oil，GSH，gene

S965

A

1003-0174（2016）09-0106-08

國家自然科學基金（31172417）

2015-01-13

林秀秀，女，1990年出生，碩士，水產動物營養與飼料

葉元土，男，1964年出生，教授，水產動物營養與飼料