含水量對不同飼料原料發酵參數的影響

劉曉明 劉法孝 李兆勇 王小明 楊在賓 李祥明

含水量對不同飼料原料發酵參數的影響

劉曉明1劉法孝1李兆勇2王小明1楊在賓1李祥明3

（山東農業大學動物科技學院1，泰安 271018）
（北京科為博生物科技有限公司2，北京 100193）
（山東省飼料質量檢驗所3，濟南 250022）

研究含水量對不同飼料原料發酵品質的影響，采用分組對照試驗設計，以乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌分別固態發酵玉米、豆粕和棉籽粕，設30%、40%、50%、60%4個含水量，以感官評價、pH和發酵后益生存留量為發酵品質評定指標。結果表明：隨發酵時間延長，pH表現二次曲線的規律（P＜0.01）；含水量顯著影響玉米、豆粕和棉籽粕的發酵（P＜0.05），不影響原料初始pH（P＞0.05）；pH達到穩定時，50%含水量的玉米、豆粕和棉籽粕的乳酸菌、枯草芽孢桿菌數量高于其他處理（P＜0.05）。本試驗條件下，乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌分別發酵玉米，最佳含水量為50%；乳酸菌、枯草芽孢桿菌分別發酵豆粕和棉籽粕，最佳含水量為60%；酵母菌發酵豆粕和棉籽粕，最佳含水量為50%。

含水量 菌種 pH 感官指標 益生菌存留量

發酵飼料是指在人工控制條件下，微生物通過自身的代謝活動，將植物性、動物性和礦物性物質中的抗營養因子分解或轉化，產生更易被動物采食、消化、吸收、利用且無毒害作用的飼料原料［1］。發酵飼料能夠改善非常規飼料的品質、提高常規飼料消化率、替代部分或全部抗生素［2］。大量研究發現：發酵飼料中含有的有益微生物和有機酸等，可增強動物機體的免疫力［3］，降低腸道pH、維持腸道健康［4-5］。但是，目前對發酵飼料的研究多集中在飼料營養成分的改變和應用效果方面，關于發酵飼料制作過程中的工藝參數鮮有報道。本試驗采用單一菌種發酵不同含水量的原料，以感官評價、原料pH變化和發酵后益生菌存留量作為測定指標，研究飼料品質隨發酵時間延長的變化規律，旨在優化制作發酵飼料的工藝參數，為指導實際生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發酵菌種：乳酸菌（Lactobacillus），3 × 109cfu／g；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），2 ×1010cfu／g；酵母菌，3×108cfu／g，北京科為博生物科技有限公司提供。

發酵原料：玉米（干物質質量分數（DM），86%；粗蛋白質量分數（CP），8.6%），豆粕（DM，89%；CP，44.8%），棉籽粕（DM，89%；CP，47.1%）。采用錘片式粉碎機（2 800轉速，40目篩）粉碎。

1.2 試驗設計

試驗選取3個發酵菌種（乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌）、3種發酵原料（玉米、豆粕、棉籽粕）。每個菌種和原料設4個含水量，分別為30%、40%、50%和60%。

1.3 試驗方法

發酵菌種按一定比例與滅菌（紫外線照射法）原料混合，加蒸餾水調節至相應處理水分含量，攪拌均勻，裝入塑料桶（15 kg），密封發酵，發酵溫度控制在35～37°C。每個處理6個重復，每12 h測量pH（每個做3個平行），連續測量12次。用12次測量pH擬合二次曲線。當各重復發酵原料pH穩定不變時，取樣，測定感官指標，檢測益生菌含量。

1.4 樣品檢測

pH：根據參考文獻［6］，稱取10 g發酵樣品，放入三角瓶中，加入90 mL蒸餾水。用磁力攪拌器攪拌30 min，靜置10 min后用pH計測定。重復3次取平均值。

物理性狀：參照GB 10220—2012［7］和GB 21172—2007［8］感官分析方法，設定在光線正常及無異味的環境下，將適量樣品倒入潔凈的白色瓷盤內或干凈的玻璃容器中，通過目測、鼻嗅、口嘗分別評定樣品的顏色、氣味等。

乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌總數：按GB 4789.35—2010［9］、GB／T 26428—2010［10］、GB 4789.15—2010［11］測定。

1.5 數據處理

數據處理采用SAS 9.1的ANOVA進行方差分析，并用Duncan′s法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著，采用Origin 9.1進行二次線性擬合（f（x）＝a x2＋b x＋c），a為二次項系數，b為一次項系數，c為常數項。

2 結果與分析

2.1 原料pH變化

不同含水量的原料達到穩定pH所需時間如圖1所示，發酵后不同含水量的玉米、豆粕和棉籽粕pH達到穩定所需時間不同。乳酸菌作為發酵菌種，含水量為50%的玉米、含水量為60%的豆粕和棉籽粕，pH首先達到穩定；酵母菌發酵不同原料，含水量為40%的玉米、含水量為50%的豆粕和棉籽粕，pH首先達到穩定；枯草芽孢桿菌發酵后，50%含水量的玉米和豆粕，60%含水量的棉籽粕pH最先達到穩定狀態。由以上結果分析可知，相同含水量的原料，達到pH穩定所需的時間玉米＜棉籽粕＜豆粕。

不同含水量的玉米、豆粕和棉籽粕經乳酸菌發酵后，原料的pH變化規律見表1。由表1可知，不同含水量的原料pH隨發酵時間的延長逐漸降低并表現出二次曲線的規律（P＜0.01）。40%、50%、60%含水量的玉米pH的擬合方程系數a和系數b顯著高于30%含水量的玉米（P＜0.05），但各處理差異不顯著（P＞0.05）。乳酸菌發酵豆粕，原料pH擬合方程a值與含水量呈正相關且差異顯著（P＜0.05），擬合方程b值與含水量呈負相關，30%和40%含水量的豆粕pH擬合方程b差異顯著（P＜0.05），其余各處理差異不顯著（P＞0.05）。乳酸菌發酵棉籽粕，除40%與50%含水量棉籽粕pH擬合方程a差異不顯著，其余各處理兩兩差異顯著（P＜0.05），擬合方程b值隨含水量升高逐漸降低并差異顯著（P＜0.05）。含水量對乳酸菌發酵玉米、豆粕和棉籽粕擬合方程c值無顯著影響（P＞0.05）。以上結果分析表明，不同原料a值最大的含水量處理不同；含水量顯著影響3種原料的pH變化，對發酵初始pH（c值）無顯著影響。

圖1 不同原料發酵達到穩定pH的時間

表1 乳酸菌發酵不同含水量的原料的pH變化規律

由表2分析可知，以酵母菌為發酵菌種，原料的pH隨時間的延長逐漸降低并表現出二次曲線的規律（P＜0.01）。酵母菌發酵玉米，50%含水量的玉米pH擬合方程a值最大，與30%和40%含水量玉米差異顯著（P＜0.05），與60%含水量玉米差異不顯著（P＞0.05）；擬合方程b值逐漸降低，40%與50%含水量處理差異顯著（P＜0.05）。酵母菌發酵豆粕，50%含水量豆粕pH擬合方程a值最大，并與其他處理差異顯著（P＜0.05），擬合方程b值與含水量呈負相關，50%與60%含水量豆粕差異顯著（P＜0.05）。酵母菌發酵棉籽粕，50%含水量棉籽粕pH擬合方程a值顯著高于其他處理，b值顯著低于其它處理（P＜0.05）。含水量對酵母菌發酵玉米、豆粕和棉籽粕擬合方程c值無顯著影響（P＞0.05）。綜上所述，3種原料經酵母菌發酵后，擬合方程a值均是50%含水量處理最大，發酵初始pH（c值）無顯著差異。

表2 酵母菌發酵不同含水量的原料的pH變化規律

從表3可以看出，枯草芽孢桿菌分別發酵不同含水量的玉米、豆粕和棉籽粕，原料的pH變化隨時間的增長逐漸降低并表現出二次曲線的規律（P＜0.01）。含水量對枯草芽孢桿菌發酵玉米pH擬合方程系數a值、b值無顯著影響（P＞0.05）。枯草芽孢桿菌發酵豆粕，擬合方程a值與含水量呈正相關，b值與含水量呈負相關，50%和60%含水量的豆粕a值、b值差異不顯著（P＞0.05），其他處理兩兩差異顯著（P＜0.05）。枯草芽孢桿菌發酵棉籽粕，擬合方程a值與含水量正相關，并差異顯著（P＜0.05）；30%與40%含水量棉籽粕擬合方程b值差異顯著（P＜0.05）。含水量對枯草芽孢桿菌發酵玉米、豆粕和棉籽粕擬合方程c值無顯著影響（P＞0.05）。由以上分析可知，含水量對枯草芽孢桿菌發酵玉米pH變化無影響，60%含水量的豆粕和棉籽粕擬合方程a值最大，發酵初始pH（c值）無顯著差異。

表3 枯草芽孢桿菌發酵不同含水量的原料的pH變化規律

2.2 感官評價

不同含水量的原料發酵后的感官品質測定結果見表4。感官性狀分析表明：玉米經乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌分別發酵后，呈現黃色、酸香味，有粘連，并且隨著含水量增加，顏色、酸味、黏度逐漸增強，50%含水量時達到最大值，含水量為60%時上述指標反而有所降低；對豆粕發酵的結果表明，3個菌種發酵后，表現為土黃色、酸香味，有粘連，隨著含水量的增加，顏色逐漸變淺，氣味和黏度逐漸增強；3個菌種分別發酵棉籽粕后，表現為酸味和弱醇香、褐色、強粘連，隨著含水率的升高，上述指標均增強。以上結果表明，3種原料發酵后顏色和氣味各呈現相應的特性，而黏度強度依次為：棉籽粕＞豆粕＞玉米。

表4 不同含水量的原料發酵后感官評價結果

2.3 菌種計數

乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌發酵不同含水量原料的益生菌計數結果見表5。由表5可以看出，含水量顯著影響不同原料的益生菌的存留量（P＜0.05）。乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌發酵玉米，50%含水量處理益生菌計數顯著高于其他處理（P＜0.05）；經乳酸菌和酵母菌分別發酵后，50%含水量的豆粕和棉籽粕益生菌存留量顯著高于其他處理（P＜0.05）；枯草芽孢桿菌發酵豆粕，40%含水量處理益生菌存留量顯著高于其他處理（P＜0.05），枯草芽孢桿菌發酵棉籽粕，40%含水量的處理益生菌存留量顯著高于其他處理（P＜0.05）。以上結果分析表明，含水量顯著影響原料發酵后益生菌數，在pH達到穩定時，益生菌存留數量：棉籽粕＞豆粕＞玉米。

表5 不同菌種發酵不同含水量的原料益生菌計數結果

3 討論

3.1 含水量對不同原料發酵pH變化的影響

在本試驗中，pH是微生物增殖最直觀的反映指標，通過數學手段分析，降低相同的pH，擬合方程二次項系數a值越大，發酵進程越快。所以，a值的大小直接能反映出發酵的快慢。以乳酸菌為發酵菌種，50%含水量的玉米、豆粕和60%含水量的棉籽粕發酵最快；以酵母菌為發酵菌種，50%含水量的玉米、豆粕和棉籽粕發酵最快；以枯草芽孢桿菌為發酵菌種，50%含水量的玉米a值最大，但差異不顯著，60%含水量的豆粕和棉籽粕a值最大并差異顯著。Malathi等［12］利用黃曲霉固態發酵生產堿性蛋白酶，對含水量的優化結果顯示，在35%～80%的含水量間，當含水量為63%時，堿性蛋白酶活性迅速增加并且活性最大；Naveena等［13］研究固態發酵嗜淀粉乳桿菌生產乳酸，在發酵條件優化過程中發現，35%～85%的含水量范圍內，當用麩皮作為底物時，含水量為83%的乳酸得率最高，而選用不同的豆類為底物時，含水量分別在75%～80%的水平下乳酸得率較高，這與本研究結果相一致。同時，楊玉芬等［14］優化復合益生菌發酵豆粕的初水分研究發現30%水分為豆粕的最佳發酵水分，與本試驗結果有差異，這可能是因為水分設置梯度不同。常數項c值大小反映了發酵初始pH，初始pH主要與基質本身性質和含水量相關。總體來說，30%含水量的處理a值都比較小，這是因為含水量過少，物料膨脹程度和營養物質溶解性低，造成微生物發酵周期較長，pH降低緩慢［15］。

3.2 含水量對不同原料發酵后感官品質的影響

發酵后顏色與原料本身高度相關且和菌種類無關，這表明發酵過程沒有破壞原料本身的色素和生成新的色素；隨著發酵水分的升高，玉米顏色逐漸加深，50%處理達到最大值，豆粕顏色逐漸降低，棉籽粕顏色逐漸加深，這是因為玉米60%處理已經介于固體和液體發酵之間，所以顏色變淺；豆粕和棉籽粕由于本身的物理特性，表現出顏色隨發酵水分的升高而變淺或加深。原料發酵氣味和微生物的代謝密切相關，乳酸菌發酵玉米（50%處理）、豆粕和棉子粕（60%處理）均表現出強酸香味，酵母菌和枯草芽孢桿菌發酵玉米（50%處理）、豆粕和棉子粕（60%處理）均表現出酸味、弱醇味。乳酸菌主導的發酵表現酸味是因為產生大量產生乳酸等有機酸所致［16］；而酵母菌和枯草芽孢桿菌主導發酵表現的醇味則是由于細菌或真菌的代謝活動在固態條件下傳質、傳熱障礙產生了醇類物質所致［17］。

3.3 含水量對基質菌種存留量的影響

菌落計數是衡量微生物發酵水平的重要指標［18］，能直接反映發酵原料和菌種的優劣性。固態發酵最大的特點是沒有或幾乎沒有游離水存在，水分含量影響到原料的物理狀態、營養物質的擴散及利用、氧和二氧化碳的交換及傳熱、傳質過程，原料含水量的變化，必然會對微生物的生長與代謝能力產生重要的影響。含水量過高，導致基質顆粒間孔隙率的降低、粘性增加，增加了氧的傳質阻力；而含水量過低，導致固態介質中營養成分溶解度的下降及較低的基質膨潤度，微生物生長受抑制［19］。因此本研究中，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌發酵不同原料，益生菌存留量最高都為含水量40%或50%處理。綜合分析3種原料，發現益生菌存留量：棉籽粕＞豆粕＞玉米，這可能是由于蛋白質含量影響益生菌的生長。陶治平［20］研究發現，蛋白質濃度對發酵體系中的酶活性有顯著影響，脫氫酶和中性蛋白酶活性都隨蛋白質濃度的增加而提高，中性蛋白酶活性上升特別明顯。微生物發酵體系中酶活性升高，有利于微生物的增殖，關于蛋白質影響發酵的具體內容有待于進一步研究探討。

4 結論

在本試驗條件下，含水量顯著影響發酵進程，不同的原料達到穩定pH所需時間不同，相同含水量的原料，達到pH穩定所需的時間：玉米＜棉籽粕＜豆粕；選擇合適含水量，可以縮減發酵時間，獲得良好的飼料品質。綜合考察各指標，乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌分別發酵玉米，適合的含水量為50%；乳酸菌、枯草芽孢桿菌分別發酵豆粕和棉籽粕，適合的含水量為60%；酵母菌發酵豆粕和棉籽粕，適合的含水量為50%。

［1］許鐠文，李元曉，龐有志.液體發酵飼料對斷奶仔豬腸道健康的影響［J］.動物營養學報，2011，23（12）：2105-2108

Xu P W，Li Y X，Pang Y Z.Fermented liquid feed：effects on weaner piglet intestinal health［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23（12）：2105-2108.

［2］王長彥，楊鳴崎，王春林，等.微生物發酵飼料對生長肥育豬生產性能的影響［J］.山東畜牧獸醫，2008（8）：7-8

Wang C Y，Yang M Q，Wang C L，et al.Effect of fermented feed on growth performance of finishing pigs［J］.Shandong Journal of Animal Science and Veterinary Medicine，2008（8）：7-8

［3］Fang H，Elina T，Heikk A.Modulation of hu-moral immune response through probiotic intake［J］.Immunology and Medical Microbiology，2000，29（1）：47-52

［4］Chen K L，Kho W L，You S H，et al.Effects of Bacillus subtilis var.natto and Saccharomycescerevisiae mixed fermented feed on the enhanced growth performance of broilers［J］.Poultry science，2009，88（2）：309-315

［5］Missotten J A M，Goris J，Michiels J，et al.Screening of isolated lactic acid bacteria as potential beneficial strains for fermented liquid pig feed production［J］.Animal Feed Science and Technology，2009，150（1）：122-138

［6］American Association of Cereal Chemists International.AACC approved methods 02-52.01 Hydrogen-ion activity（pH）：Electrometric method［S］.St.Paul，MN：The Association，2000

［7］GB／T 10220—2012 感官分析方法學總論［S］. 北京：中國標準出版社，2012

GB／T 10220—2012 Sensory analysis methods［S］.Beijing：China Standard Press，2012

［8］GB／T 21172—2007感官分析食品顏色評價的總則和檢驗方法［S］.北京：中國標準出版社，2007

GB／T 21172—2007 Sensory analysis method and general inspection of food color evaluation ［S］.Beijing：China Standard Press，2007

［9］GB 4789.35—2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗［S］.北京：中國標準出版社，2010

GB 4789.35—2010 Food safety national standard food microbiology laboratory test of lactic acid bacteria［S］.Beijing：China Standard Press，2010

［10］GB／T 26428—2010飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測［S］.北京：中國標準出版社，2011

GB／T 26428—2010 Detection of microbial feed preparation in Bacillus subtilis ［S］.Beijing：China Standard Press，2011

［11］GB 4789.15—2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數［S］.北京：中國標準出版社，2010

GB 4789.15-2010 Food safety national standard food microbiology laboratory test mold and yeast count［S］.Beijing：China Standard Press，2010

［12］Malathi S，Chakraborty R.Production of alkaline protease by a new Aspergillus flavus isolate under solid-substrate fermentation conditions for use as a depilation agent［J］.Applied and Environmental Microbiology，1991，57（3）：712-716

［13］Naveena B J，Vishnu C，Altaf M，et al.Wheat bran an inexpensive substrate for production of lactic acid in solid state fermentation by Lactobacillus amylophilus GV6-optimization of fermentation conditions［J］.Journal of Scientific and Scientific and Industrial Research，2003，62（5）：453-456

［14］楊玉芬，孟洪莉，張力.發酵溫度和水分對菜籽粕發酵品質的影響［J］. 中國農學通報，2010，26（8）：52-55

Yang Y F，Meng H L，Zhang L.The Effects of temperature and moisture on fermented quality of rapeseed meal［J］Chinese Agricultural Science Bulletin，2010，26（8）：52-55

［15］崔景麗.益生菌L.casei Zhang固態發酵特性的研究［D］.呼和浩特：內蒙古農業大學，2008

Cui J L.Study on Fermentation characteristics of probiotic Lactobacillus casei Zhang solid state system［D］.Huhehaote：Inner Mongolia Agricultural University，2008

［16］覃春富，范永輝，張佩華，等.不同乳酸茵組合對發酵液體飼料品質的影響［J］.中國畜牧獸醫，2013，40（9）：114-118

Tan C F，Fan Y H，Zhang P H，et al.Effect of different Lactobacillus forms on quality of fermentation liquid feed［J］.China Animal Husbandry ＆ Veterinary Medicine，2013，40（9）：114-118

［17］李紹章，趙娜，楊學海，等.不同工藝對益生菌發酵飼料感觀，pH值與重量損耗的影響［J］.飼料工業，2010，31（18）：31-34

Li SZ，Zhao N，Yang X H，et al.Research on the effect of sensory analysis，pH and weight wasting of lactobacillus plantarum fermentated feed technology ［J］.Feed Industry，2010，31（18）：31-34

［18］Savard P，Lamarche B，Paradis M E，et al.Impact of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12 and Lactobacillus acidophilus LA-5-containing yoghurt，on fecal bacterial counts of healthy adults［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，149（1）：50-57

［19］Chahal D S.Solid-state fermentation with Trichoderma reesei for cellulaseproduction［J］.Applied and Environmental Microbiology，1985，49（1）：205-210

［20］陶治平.氯化鈉和蛋白質對餐廚垃圾厭氧發酵的影響研究［D］.江南大學，2013

Tao Z P.Effect of NaCl and protein on anaerobic digestion of food waste［D］.Jiangnan University，2013.

Effects of Water Content on Fermentation Parameters of Different Fodder Substrates

Liu Xiaoming1Liu Faxiao1Li Zhaoyong2Wang Xiaoming1Yang Zaibin1Li Xiangming3
（College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University1，Taian 271018）
（CRVAB Bio-tech Group2，Beijing 100193）
（Shandong Feed Quality Ispection Institute3，Jinan 250022）

In this study，the effects of moisture content on fermentation quality were investigated.This study adopted the grouping control experimental design，using solid-fermentation on corn，soybean meal，and cottonseed meal through different strains（Lactobacillus，yeast and bacillussubtilis），under four moisture contents，30%，40%，50%and 60%and with sensory evaluation，pH and amount of probiotics retention as the indicators of fermentation quality assessment.Results indicated that with the extension of fermentation time，the pH showd the law of quadratic curve（P ＜0.01），Water content had a significant influence on the fermentation process of corn，soybean meal and cottonseed meal（P ＜0.05），but has no effect on the initial pH of raw materials（P ＞0.05）.When pH remains stable，the number of lactobacillus and bacillus subtilis for corn，soybean meal and cottonseed meal with 50%moisture content was significantly higher than other treatment（P ＜0.05）.The optimum suitable amount of water was 50%when lactobacillus，yeast or bacillus subtilis were used to fermente corn；And the most suitable amount of water was 60%when soybean meal or cottonseed meal was fermented by lactobacillus or bacillus subtilis；If the soybean meal and cottonseed meal were fermented with yeast，the most suitable amount of water was 50%.

water content，strain，pH，sensory parameters，residual probiotic

S816.6

A

1003-0174（2016）09-0100-06

山東省現代農業產業技術體系生豬創新團隊建設（SDAIT-06-022-04）

2014-11-29

劉曉明，男，1988年出生，碩士，動物營養與飼料科學

楊在賓，男，1961年出生，教授，博士生導師，動物營養與飼料科學