DL—乙硫氨酸對大鼠肝細胞脂肪變性的影響

摘要：為研究肝細胞脂肪變性后發生的變化。采用體外培養DL-乙硫氨酸誘導的大鼠原代肝細胞作為試驗材料。油紅O染色經5.0 mmol/L DL-乙硫氨酸處理的貼壁良好培養24 h和48 h的肝細胞，光學顯微鏡400倍下觀察肝細胞的脂質變化，拍照，分析生化指標數據。結果表明，對照組細胞內可見正常脂滴，大量大小不一顏色鮮紅的脂滴染色后匯集成塊于模型組細胞胞漿內。模型組載脂蛋白B含量降低，甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白含量升高，與對照組比較差異極顯著（P<0.01）。

關鍵詞：細胞培養；脂肪肝；油紅O染色；DL-乙硫氨酸

中圖分類號：S852.35 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0689-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.035

Abstract： To investigate the change of hepatocytes adipose degeneration. The rat primary cultured hepatocytes induced by DL-ethionine were used.The normal aladhered hepatocytes were treated with 5.0 mmol/L DL-ethionine for 24 h and 48 h，stained with oil red O and observed under microscope 400×， meanwhile some biological indices were measured and analysised.The results as follows：there were a few normal lipid droplets in the hepatocytes of control group， but many of them in the hepatocytes of model group， bright red color，and some lipid droplets were flaky. The contents of triglyceride， low density lipoprotein and high density lipoprotein go to heighten in model group，apolipoprotein B to lower，and between the control model group and model group were significant（P<0.01）. The further observation of hepatocytes adipose degeneration was carried out， and it provide correct in vitro investigation of fatty liver patient.

Key words：hepatocyte culture；fatty liver；oil red O staining；DL-ethionine

脂肪肝的基礎是肝臟脂質代謝穩態發生變化，體內及肝內脂質的動態平衡被打破，引發肝細胞合成、轉運和分解紊亂。目前脂肪肝試驗研究中常用的動物病理模型是藥物誘導脂肪肝模型，誘因是載脂蛋白復合物的合成受藥物影響，當含量下降時，極低密度脂蛋白（VLDL）含量增加，肝臟脂肪轉運不出去，肝臟脂肪病變由此產生[1-4]。保肝藥物的臨床試驗大多從動物活體上獲取，費時費力，本研究從分離、體外培養和藥物誘導后脂肪變性的肝細胞的形態、生理指標的變化來分析肝細胞發生的變化，為保肝藥物的研究提供試驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗動物用1～2月齡健康清潔級SD雄性大鼠由河北省實驗動物中心提供。參照文獻[5-7]配制二步灌流法需要的洗液；試驗儀器和試驗材料由河北農業大學細胞培養實驗室提供。

1.2 培養與檢測

分離培養原代肝細胞[8-10]，酸泡滅菌的蓋玻片鋪于培養板中，消毒槍頭抵住蓋玻片再鋪血清與肝細胞混合液，防止蓋玻片上浮產生縫隙，細胞不易于貼壁生長。

倒置相差顯微鏡觀察貼壁細胞生長情況，5.0 mmol/L DL-乙硫氨酸處理貼壁生長良好的肝細胞為模型組，正常培養基培養的為對照組，分別培養24 h和48 h。

10%中性甲醛浸泡被冷的PBS（pH 7.2）液沖掉雜質的蓋玻片30 min，油紅O用于染色脂滴，蘇木精用于染色細胞核，明膠封片，拍照。

單因子方差分析對照組和模型組24 h和48 h細胞裂解液中的TG、ApoB、LDL和HDL的含量。

2 結果與分析

2.1 油紅O染色觀察

鏡檢可見，對照組脂滴正常分布于細胞內（圖1-a）；模型組細胞內分布有多個顏色濕潤濃深的橘紅色脂滴，細胞核變小，說明肝細胞核損傷已形成，有的地方脂滴匯聚成團，將細胞核壓向一邊，形態與對照組比較有顯著變化（圖1-b）。

2.2 DL-乙硫氨酸作用24 h和48 h后TG與ApoB含量

由表1可知，模型組細胞液中TG與ApoB含量與對照組相比，TG含量極顯著（P<0.01）升高，ApoB含量極顯著（P<0.01）下降。

2.3 DL-乙硫氨酸作用24 h和48 h后LDL與HDL含量

由表2可知，模型組細胞液中LDL、HDL含量與對照組相比，均極顯著（P<0.01）升高。

3 討論

肝細胞內TG堆積的病理形態與濃度的變化證明肝細胞發生了脂肪變性。脂肪變性成功的大鼠肝細胞，與其他因素誘導成功的共同特征體現在：油紅O染色細胞內脂滴匯聚成團，從脂滴的顏色和數量可以看出TG含量增加，表明DL-乙硫氨酸誘導的結果已經在肝細胞脂質代謝中體現。從生化指標數據看出，DL-乙硫氨酸作用24 h時，TG從0.249 mmol/L升到1.285 mmol/L，說明細胞內匯集有大量TG，與肝細胞脂肪化的病理形態相符合。

細胞內能攝入ApoB介導的脂蛋白與細胞膜上的脂蛋白受體并被分解代謝，apoB含量下降，阻礙了TG從細胞內的轉運。從數據可以看出，DL-乙硫氨酸作用24 h時，各項指標濃度變化比48h明顯，說明肝臟有一定的自我調節功能，但對于一些急性肝損傷還是需要藥物治療。肝細胞中apoB濃度的變化密切關系著HDL，LDL的含量。ApoB濃度下降，HDL和LDL濃度升高，在添加DL-乙硫氨酸后變化明顯。ApoB參與VLDL的合成、分泌，當含量下降時，VLDL含量增加。載脂蛋白B的復合物合成過程被乙硫氨酸的乙基活動末端所阻擾，合成降低。因此，VLDL轉運不出去，TG含量升高。

總之，肝細胞發生脂肪變性的方法可由DL-乙硫氨酸誘導其取得。從而對肝細胞脂肪變性有了更進一步的研究，為脂肪肝患者實施正確的治療方案助一臂之力。

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