黃瓜內生真菌對根結線蟲生防活性測定

摘要：為了明確黃瓜根結內生真菌對根結線蟲（Meloidogyne incognita）的防效，采用菌株發酵液對根結線蟲進行離體活性和盆栽防效測定，結果表明，菌株經形態和18S rDNA鑒定為Plectosphaerella sp.，其發酵液對根結線蟲處理48 h的致死活性為93.73%；盆栽試驗表明，Plectosphaerella sp.對根結線蟲的防效為56.1%。發酵液處理的黃瓜根系卵塊數量少于對照，土壤中根結線蟲2齡幼蟲數量也少于對照。總體來看，Plectosphaerella sp.對根結線蟲具有較高的生防活性，能為黃瓜根結線蟲生物防治奠定基礎。

關鍵詞：黃瓜； 內生真菌； 生物防治； 根結線蟲（Meloidogyne incognita）

中圖分類號：S432.4+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0634-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.022

Abstract： To assess bioncontrol activity against root knot nematode by an endophytic fungus isolated from cucumber root galls，the biocontrol potential of the fungus was analyzed through in vitro test and pot experiment. The fungus was identified as Plectosphaerella sp. according to morphological characteristics and 18S rDNA sequences. The fungal fermentation broth killed 93.73% of root knot nematode for 48 h. The control efficiency of Plectosphaerella sp. revealed by pot experiment was 56.1%. The number of egg mass on cucumber root and population of root knot nematode in soil treated by fungus were higher than that by control. In a conclusion，the fungus possessed high biocontrol activity against root knot nematode.

Key words： cucumber； endophytic fungus； biocontrol； Meloidogyne incognita

黃瓜是全世界范圍內廣泛種植的一種蔬菜。中國黃瓜栽培面積占蔬菜總面積的10%左右，黃瓜設施栽培占黃瓜總面積的80%。根結線蟲病是黃瓜生產中的重要病害，特別在設施栽培環境中，高溫、高濕以及常年連作為根結線蟲的發生提供了有利條件。目前使用最廣泛的防治方法是施用化學殺線劑，但化學殺線劑帶來的環境、毒性等問題，給蔬菜安全生產提出了新的要求。

生物防治是綠色環保的防治手段，其中內生真菌防治植物寄生線蟲最具有發展潛力。番茄根部內生尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）菌株能使南方根結線蟲的侵染率降低55%[1]，而從香蕉上分離到的內生鐮刀菌使香蕉穿孔線蟲（Radopholus similis）的抑制率達到了39%～85%[2]。根結線蟲生防菌（Paecilomyces lilacinus） Strain 251能夠減少番茄66%的根結數量、74%的卵塊數量和土壤中71%的線蟲數量[3]。黃瓜根結線蟲生物防治應用較多的是菌根真菌，如Glomus intraradices，G. mosseae和G. versiforme等[4]，以及尖孢鐮刀菌Fo47和CS-20[5]，它們能夠誘導黃瓜產生系統抗病性，抵抗根結線蟲侵染。這些真菌均分離于健康的植物組織，在應用過程中真菌并未定植在根結部位，并未充分發揮防效。從發病組織能夠分離到相應病原菌的生防微生物，田雪亮等[6]從番茄根結中分離到一株對根結線蟲具有良好防效的內生真菌交織枝頂孢（Acremonium implicatum）。

本研究從根結線蟲重病田種植的黃瓜根結中分離到一株內生真菌，并對其進行了抑制根結線蟲活性測定和盆栽試驗測定，以期為根結線蟲生物防治開發新途徑。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

黃瓜根結樣品采集于溫室大棚，該棚種植黃瓜多年，且根結線蟲發病較重。選取10株發病較重、根結較大的黃瓜，抖落根系泥土，將根結帶回實驗室備用。

1.2 黃瓜根結內生真菌分離

選擇直徑1.0 cm，未腐爛的根結，用自來水沖洗根結表面泥土，無菌刀片削掉根結表皮，然后在75%乙醇中浸泡1 min，轉入1%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，最后用無菌水沖洗3次。在無菌條件下將根結切成直徑0.5 cm的組織塊，擺放于PDA平板（含40 μg/mL的氨芐青霉素），置于25 ℃恒溫箱培養，待菌落長出后，挑取菌絲到新的PDA平板上進行純化。

1.3 菌株分子鑒定

取0.2～0.5 g菌絲用于基因組DNA的提取，參考Al-Samarrai等[7]方法并稍作修改，將DNA稀釋至100 μg/μL，-20 ℃保存備用。采用18S rDNA通用引物NS17UCB，5′-CATGT CTAAG TTTAA GCAA-3′；NS18UCB，5′-CTCAT TCCAA TTACA -3′[8]擴增真菌的18S rDNA區域。PCR反應體系：10×Buffer 2 μL，dNTPs （5 mmol/L） 1.2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，用ddH2O補足20 μL體系。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共31個循環；72 ℃延伸10 min，16 ℃保溫2 h。PCR產物測序所得序列，登陸NCBI進行BLAST比對，下載與真菌相似度高的其他真菌18S rDNA序列，采用MEGA4.0軟件以鄰接法構建進化樹[9]。

1.4 菌株對根結線蟲致死活性測定

挑取菌株菌絲接入含有PDB培養液的三角瓶中，25 ℃，110 r/min振蕩培養7 d，即得到發酵液。將菌株發酵液經細菌過濾器過濾和高溫滅菌處理，得到原液和滅菌發酵液，進行殺根結線蟲2齡幼蟲的活性檢測。分別取4 mL發酵原液和高溫滅菌發酵液置于培養皿，然后加入約100條根結線蟲2齡幼蟲，置于25 ℃條件下培養24、48 h。將所有線蟲在清水中恢復2 h，不活動的線蟲記為死亡[10]。統計線蟲死亡數量，計算校正死亡率。以無菌水為對照，每個處理重復5次。

校正死亡率=（處理死亡率-對照死亡率） /（1-對照死亡率）×100%

1.5 盆栽防效測定

黃瓜種子經過70%乙醇表面消毒以后，種植于苗盤內。待黃瓜長至三葉期，輕輕拔出黃瓜苗，浸在培養7 d的菌株發酵液內20 s，然后種植于無菌草炭土內，生長7 d后接種5 mL根結線蟲懸浮液（含約1 000條2齡幼蟲），處理10株，以無菌水為對照，重復3次。在生長期間進行正常管理，接種30 d以后，調查根結線蟲情況。用清水將根系沖洗干凈后調查并統計根結線蟲數量，計算防治效果[11]。

盆栽防效=[（對照根結數-處理根結數）/對照根結數]×100%

2 結果與分析

2.1 菌株物種鑒定

在PDA培養基上生長7 d后，菌落直徑為4 cm左右。菌落白色，呈絨毛狀。分生孢子橢圓形或長橢圓形，長5.4～5.8 μm，寬2.2～2.8 μm。分生孢子有膈膜，多胞（圖1）。

分離菌株在進化樹上與Plectosphaerella sp.位于同一進化分支，且相似度為100，表明菌株與Plectosphaerella sp.親緣關系近。結合菌株的形態特征，將菌株鑒定為Plectosphaerella sp.。由于未獲得具體物種名，將其暫命名為Strain 12（圖2）。

2.2 菌株發酵液對根結線蟲的致死活性

由圖3可以看出，根結線蟲2齡幼蟲經菌株發酵液處理時間越長，線蟲死亡率就越高，48 h處理線蟲死亡率高于24 h處理。菌株發酵原液處理根結線蟲24、48 h，線蟲校正死亡率為93.07%和93.73%，高于高溫滅菌發酵液對線蟲的校正死亡率87.98%和90.53%。高溫滅菌可能對發酵液某些物質產生影響，造成線蟲校正死亡率稍微降低，但主要的殺線蟲物質的活性并未喪失，表明該物質具有較高的熱穩定性。

2.3 菌株對根結線蟲的盆栽防效測定

從圖4A看出，菌株發酵液處理黃瓜的根結線蟲數量為61.3個，而對照處理的黃瓜根結數量為139.7個，差異顯著（P<0.05）。根據公式計算，發酵液的防效為56.10%。菌株發酵液處理的黃瓜根系上根結線蟲卵塊數量為17個，而對照黃瓜根系卵塊數量為53個，差異顯著（P<0.05）（圖4B）。此外，發酵液處理后，土壤中根結線蟲2齡幼蟲數量為69.7頭，而對照土壤中根結線蟲2齡幼蟲數量為325.3頭，顯著高于發酵液處理（圖4C）。經發酵液處理后，黃瓜的根系較發達，根結數量少且小。

3 小結與討論

內生真菌普遍存在于植物體內，能夠產生次生代謝物質保護植物或調解植物生長，甚至抵抗某些植物病原物的侵染，是一類非常有潛力的生防微生物。植物病原物的侵染能夠改變植物內生真菌群落結構，如根結線蟲侵染能夠誘導植物內生真菌種類改變，誘導某些對線蟲有生防活性的真菌在根結部位定殖[12]，從而起到保護植物的作用。因此，從植物根結組織中能夠分離到對線蟲生防活性較高的內生真菌。

筆直枝頂孢（Acremonium strictum）[13]和交織枝頂孢（A. implicatum）[5]分離于番茄根結，具有殺線蟲活性、卵孵化抑制活性和卵寄生活性，對根結線蟲防治效果較好。本研究Plectosphaerella sp.分離于黃瓜根結，對根結線蟲具有較高的致死活性，其發酵液對線蟲校正死亡率為93.73%，稍低于交織枝頂孢的96.00%。此外，Plectosphaerella sp.盆栽防效為56.10%，也低于交織枝頂孢的66.70%，與非致病性尖孢鐮刀菌Fo47和CS-20防效相當，具有應用價值。

相對于其他生防微生物，利用內生真菌防治線蟲具有3方面優勢。首先，內生真菌與植物線蟲具有相似的生態位點，充分發揮其拮抗作用；其次，內生真菌大部分生活史在植物體內完成，其生存和繁殖受外部環境影響較小，避免了與土壤其他微生物之間的強烈競爭；再次，大部分內生真菌可以離體培養，具有大規模工廠化生產的可行性，能夠開發生防菌劑[14]。本研究中，黃瓜根結經過嚴格的表面消毒，因此分離的真菌Plectosphaerella sp.為黃瓜內生真菌。內生真菌克服了普通生防菌難以在土壤中定殖的問題，能夠在植物組織內持續發揮拮抗線蟲的作用，因此具有較高的防治效果，是最具前景的生防資源[15]。

下一步研究工作將集中于分離并鑒定對根結線蟲具有生防活性的物質，為研制新型、環境友好型的殺線微生物源農藥提供技術支撐。

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