響應面優化超聲波—酶法提取丹參中丹酚酸B的工藝研究

摘要：利用響應面分析法對丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）中丹酚酸B的超聲波協同酶法提取工藝進行優化。在單因素試驗基礎上，選取酶解時間、酶解溫度、纖維素酶用量和酶解pH進行4因素3水平的Box-Behnken中心組合研究。通過響應面分析法對提取條件進行了優化，確定超聲波協同酶法提取丹參中丹酚酸B的最佳工藝為酶解時間54 min，酶解溫度49 ℃，纖維素酶用量2.70 mg/g、酶解pH 4.4。在該條件下，丹參中丹酚酸B的提取量為4.83 mg/g。

關鍵詞：丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）；丹酚酸B；纖維素酶；超聲法

中圖分類號：S567.5；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0444-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.046

丹參藥材為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根和根莖。臨床上用于通經止痛、活血化瘀等[1]。丹參含有萜類[2]、酚酸類[3]、多糖類[4]等多種化學成分，其中丹酚酸B是丹參藥材的質控成分之一[1]。體內藥理試驗研究表明，丹酚酸B具有抑制口腔癌前病變[5]、保護心肌[6]、改善肺循環[7]等活性。

目前已報道的丹參中丹酚酸B的提取方法主要有煎煮法[8]、超聲波法[8]、微波法[9]、減壓提取法[10]等。其中，超聲波法是利用機械作用、空化作用、熱效應等從而促進有效成分從藥材中轉移至溶劑中的一個過程，具有高效、節能的特點[11]。生物酶解技術通過酶解作用可使植物細胞壁疏松、破裂，從而降低傳質阻力，促進有效成分的溶出，提高有效成分提取率，因而被越來越多地用于中藥有效成分的提取當中[12]。試驗采用超聲波協同酶法提取丹參中丹酚酸B，通過響應面法優化酶解條件，為丹參中丹酚酸B的開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹參購買于重慶市中藥材市場，經過銅仁職業技術學院藥學院梁玉勇教授鑒定為唇形科植物丹參的干燥根莖；丹酚酸B標準品購于中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶（天津利華酶制劑技術有限公司，酶活力：10 000 U/g）；水為重蒸水；甲醇為色譜純；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-300VDB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB-135S型十萬分之一電子天平（德國梅特勒公司）；RE-2000A型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；PHS-25型酸度計（杭州亞美電子儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永鑫實驗儀器設備廠）；FZ102微型植物粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 丹酚酸B的含量測定

1）色譜條件[1]。Diamonsil C18柱（5 μm，4.6 mm×150.0 mm）；流動相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59，V/V/V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：286 nm；進樣量：10 μL。該色譜條件下理論塔板數以丹酚酸B峰計算不低于2 000。該色譜條件下測定丹酚酸B標準品及丹參藥材得到的色譜見圖1。

2）標準曲線的繪制。精密稱定丹酚酸B標準品12 mg置于25 mL容量瓶中，并用75%甲醇定容至刻度，搖勻，得0.48 mg/mL丹酚酸B標準溶液。精確移取丹酚酸B標準品溶液0.15、0.30、0.60、1.20、2.40 mL至10 mL容量瓶中，用75%甲醇定容至刻度。精密吸取所配制的不同濃度的標準品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測定峰面積，并以峰面積為縱坐標（Y），以進樣量（X）為橫坐標繪制標準曲線得Y=1 329.8X-9.107，R2=0.999 9，線性范圍：0.072～1.152 μg。

3）丹參中丹酚酸B的含量測定。取濃縮至100 mL的丹酚酸B提取液，精密移取0.5 mL至25 mL容量瓶中，用75%甲醇定容至刻度，搖勻，所得溶液用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液10 μL按照上述色譜條件進行測定，并根據峰面積計算丹酚酸B的提取量。丹酚酸B提取量按照如下公式進行計算：

丹酚酸B提取量=提取得到的丹酚酸B的質量/丹參藥材的質量。

1.2.2 丹參中丹酚酸B的提取工藝流程 丹參中丹酚酸B的提取工藝流程如下：丹參→干燥、粉碎（過40目篩）→酶解→微波提取→合并提取液→減壓濃縮至100 mL→測定丹酚酸B含量，并計算丹酚酸B提取量。其中，超聲波提取條件的工藝參數為：以水為提取溶劑、固液比1∶10（g∶mL）、超聲功率為300 W，超聲時間15 min提取2次。

1.2.3 單因素試驗

1）酶解時間。準確稱取10 g丹參粉末置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解溫度為45 ℃、纖維素酶用量為2.5 mg/g、酶解pH為4.0的條件下，考察不同酶解時間（30、40、50、60、70 min）對丹酚酸B提取量的影響。

2）酶解溫度。準確稱取10 g丹參粉末置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解時間為50 min、纖維素酶用量為2.5 mg/g、酶解pH為4.0的條件下，考察不同酶解溫度（35、40、45、50、55 ℃）對丹酚酸B提取量的影響。

3）纖維素酶用量。準確稱取10 g丹參粉末置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解時間為50 min、酶解溫度為45 ℃、酶解pH為4.0的條件下，考察不同纖維素酶用量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/g）對丹酚酸B提取量的影響。

4）酶解pH。準確稱取10 g丹參粉末置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解時間為50 min、酶解溫度為45 ℃、纖維素酶用量為2.5 mg/g的條件下，考察不同酶解pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）對丹酚酸B提取量的影響。

1.2.4 響應面法優化試驗 根據單因素試驗結果，進一步考查酶解時間、酶解溫度、纖維素酶用量以及酶解pH對丹酚酸B提取量（Y）的影響。采用Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken中心組合試驗設計原理對所選變量進行響應面設計，其因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶解時間對丹參中丹酚酸B提取量的影響

由圖2可知，酶解時間在30～50 min時，丹酚酸B隨著酶解時間的延長提取量顯著升高。當酶解時間達到50 min，丹酚酸B的提取量達到最大，隨著酶解時間的繼續延長丹酚酸B提取量增加緩慢。因此酶解時間宜選在50 min左右。

2.1.2 酶解溫度對丹參中丹酚酸B提取量的影響 由圖3可知，丹酚酸B提取量隨著酶解溫度的升高而升高。當酶解溫度超過50 ℃后，丹酚酸B提取量有所下降。這是由于隨著溫度升高，纖維素酶活性不斷增大，但當溫度超過纖維素酶的最適溫度時可引起纖維素酶的失活。此外，丹酚酸B的穩定性容易受到溫度影響，溫度過高可引起丹酚酸B的降解[13，14]。因此酶解溫度宜選擇在50 ℃左右。

2.1.3 纖維素酶用量對丹參中丹酚酸B提取量的影響 由圖4可知，丹酚酸B提取量隨著纖維素酶用量的增加而升高。當纖維素酶用量為2.5 mg/g時丹酚酸B的提取量達到最大，隨著纖維素酶用量的進一步增加，丹酚酸B提取量增加緩慢。因此最佳纖維素酶用量應選在2.5 mg/g左右。

2.1.4 酶解pH對丹參中丹酚酸B提取量的影響 由圖5可知，當酶解pH為4.5時，丹酚酸B的提取量達到最大。這是由于過低或過高的pH均不利于纖維素酶酶活性的發揮，從而影響纖維素酶降解植物細胞壁的效果，最終影響植物中有效成分的提取。此外，丹酚酸B的穩定性容易受到溶液pH影響，研究表明酸性體系有利于丹酚酸B的穩定，但是如果酸性過強則會引起丹酚酸B的降解[13，14]。因此酶解pH宜選擇在4.5左右。

2.2 響應面的試驗結果

響應面試驗結果見表2。由Design-Expert 8.0.6軟件對表2中數據進行回歸擬合得到的二元多項回歸方程為：Y=4.790+0.150X1-0.070X2+0.055X3-0.120X4+0.058X1X2+0.040X1X3+0.015X1X4-0.030X2X3-0.012X2X4+0.010X3X4-0.180X12-0.220X22-0.084X32-0.270X42。

該模型回歸方程的方差分析結果見表3。由表3中數據可知，模型極顯著（P<0.000 1），失擬項（P=0.361 1）不顯著，表明回歸方程擬合度和可信度較高，試驗誤差較小，可用于指導丹酚酸B提取試驗。模型中決定系數為0.959 8，調整決定系數為0.919 5，表明響應值91.95%的變化來源于所選變量；模型的變異系數為1.39%（<10%），表明試驗有良好的穩定性。由表3可知，一次項X1、X2、X3、X4及二次項X12、X22、X32和X42均對丹酚酸B提取量的影響極顯著，而交互項對丹酚酸B提取量的影響較小。根據F值可判斷，各個因素對丹酚酸B提取量的影響順序為：酶解時間>酶解pH >酶解溫度>纖維素酶用量。

圖6是Design-Expert 8.0.6軟件根據表2數據繪制的響應面圖，直觀描述所考察的4個因素（酶解時間、酶解溫度、纖維素酶用量、酶解pH）兩兩交互作用對丹參中丹酚酸B提取量的影響。經過Design Expert 8.0.6軟件的分析，得到丹參中丹酚酸B酶解的最佳工藝條件為：酶解時間54.25 min，酶解溫度49.36 ℃，纖維素酶用量2.72 mg/g、酶解pH 4.40。在此條件下，丹酚酸B理論提取量為4.85 mg/g。為驗證方法的可行性，采用上述酶解條件對丹參進行超聲-酶法提取丹酚酸B的試驗，為方便操作，將上述優化的條件調整為酶解時間54 min，酶解溫度49 ℃，纖維素酶用量2.70 mg/g、酶解pH 4.4。在此優化條件下做3組平行試驗，測定丹酚酸B平均提取量為4.83 mg/g，試驗結果與模型預測相對誤差僅為0.41%。

3 結論

本研究以丹參中丹酚酸B提取量為指標，通過單因素試驗對纖維素酶用量、酶解時間、酶解pH以及酶解溫度進行了考察。在此基礎上，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken的中心組合試驗設計響應面試驗進而建立了數學模型，得到優化的酶解處理丹參藥材的工藝條件為酶解時間54 min，酶解溫度49 ℃，纖維素酶用量2.70 mg/g、酶解pH 4.4。在該條件下丹參中丹酚酸B的提取量達到4.83 mg/g。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[2] WANG Z， CAO B， YU A，et al. Ultrasound-assisted ionic liquid-based homogeneous liquid–liquid microextraction high-performance liquid chromatography for determination of tanshinones in Salvia miltiorrhiza Bge. root[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2015， 104： 97-104.

[3] ZHANG J，HE Y，CUI M，et al. Metabolic studies on the total phenolic acids from the roots of Salvia miltiorrhiza in rats[J]. Biomedical Chromatography， 2005， 19（1）： 51-59.

[4] WU W，ZHU Y，ZHANG L， et al. Extraction preliminary structural characterization，and antioxidant activities of polysaccharides from Salvia miltiorrhiza Bunge[J].Carbohydrate Polymers，2012，87（2）：1348-1353.

[5] ZHOU Z T，YANG Y，GE J P.The preventive effect of salvianolic acid B on malignant transformation of DMBA-induced oral premalignant lesion in hamsters[J].Carcinogenesis，2006， 27（4）：826-832.

[6] XUE L，WU Z，JI X P，et al. Effect and mechanism of salvianolic acid B on the myocardial ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2014， 7（4）：280-284.

[7] LIN F，LIU Y Y，XU B，et al. Salvianolic acid B protects from pulmonary microcirculation disturbance induced by lipopolysaccharide in rat[J]. Shock，2013，39（3）：317-325.

[8] 張 昀，劉 路，李 欽.丹參中丹酚酸 B的提取工藝研究[J].中草藥，2007，38（8）：1193-1194.

[9] 韓 偉，孫金蘭，劉志平.微波輔助提取丹參中丹酚酸B[J].南京工業大學學報（自然科學版），2008，30（2）：1-5.

[10] 韓 麗，黃 娟，楊秀梅，等.丹參水溶性成分丹酚酸B減壓提取工藝研究[J].中華中醫藥雜志，2013，28（11）：3201-3203.

[11] 高鐿萌，徐愿堅，杜洪飛，等.中藥提取新技術的研究進展[J].世界科學技術——中醫藥現代化，2014（4）：890-894.

[12] 宋成英.酶解技術在中藥提取中的應用研究[J].時珍國醫國藥，2013，24（8）：1934-1935.

[13] 張文芯，玄 律，倪 健.丹酚酸B在水溶液中的穩定性研究[J].北京中醫藥大學學報，2009（12）：856-858.

[14] 張 軍，王鳳云，詹麗玲，等.丹參藥材提取液中丹酚酸B穩定性影響因素的考察[J].中國中藥雜志，2005，30（10）：789-790.