活禽市場雞源大腸桿菌的分離與鑒定

摘要：從山東聊城地區活禽市場雞糞便中通過無菌操作分離、純化得到純種菌種34株，并進行革蘭氏染色、鏡檢、生化鑒定試驗。結果表明，34株菌均符合大腸桿菌（Escherichia coli）的培養特性。

關鍵詞：雞；大腸桿菌（Escherichia coli）；分離純化；生化鑒定

中圖分類號：S858.312.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）02-0428-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.02.041

雞大腸桿菌病是由大腸桿菌（Escherichia coli）中的某些致病性菌株引起的雞感染性疾病的總稱，其中包括大腸桿菌性腹膜炎、輸卵管炎、臍炎、滑膜炎、氣囊炎、肉芽腫、眼炎等多種疾病，也有可能在心臟、胰臟、腸道出現黃白色肉芽腫，主要表現為敗血型、氣囊炎、心包炎、肝周炎和腸類型[1]，是養雞生產中常見的一種傳染病，該病可增加其他病原體感染的機會，對養殖業及食品安全有較大影響。為了解大腸桿菌的特性，并為防治該病提供科學依據，本試驗從雞糞便中通過無菌操作獲取大腸桿菌，經過菌種的分離、純化得到純種菌種，并進行了革蘭氏染色、鏡檢、生化鑒定試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 糞便無菌采于山東省聊城地區活禽市場的健康雞，置于冰箱-4 ℃保存，備用。

1.1.2 菌種來源 CVCC1551、CVCC1553購于中國獸醫藥品監察所。

1.1.3 試劑 伊紅美藍培養基、麥康凱瓊脂培養基、營養肉湯培養基、普通營養瓊脂、糖發酵培養基、三糖鐵瓊脂、生化試驗鑒定管、各種生物化學試劑均購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養與純化 無菌條件下將樣本分別接種于伊紅美藍培養基置37 ℃恒溫箱培養24 h后，挑取紫黑色帶金屬光澤的菌落，連續兩次接種于麥康凱瓊脂平板，繼續培養24 h。觀察麥康凱瓊脂平板上的菌落，選紅色菌落進行抹片、革蘭氏染色鏡檢[2-5]。

1.2.2 生化試驗 取細菌純培養物分別接種在吲哚試驗管、M-R試驗管、V-P試驗管、枸櫞酸鹽試驗管中，并做三糖鐵試驗、尿素酶試驗、觸酶試驗、半固體營養瓊脂穿刺試驗、淀粉試驗，其中觸酶試驗立刻觀察，其他試驗分別置37 ℃溫箱搖床培養。吲哚試驗、M-R試驗、尿素酶試驗、半固體營養瓊脂穿刺試驗、淀粉試驗于24 h觀察，V-P試驗于48 h滴加試劑觀察，枸櫞酸鹽試驗于96 h觀察試驗結果[6-8]。1.2.3 糖發酵試驗 取細菌純培養物接種6種糖類微量發酵管（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖發酵管），置37 ℃培養24～48 h后進行觀察。

2 結果與分析

2.1 細菌培養特征

細菌培養結果可見，在伊紅美藍瓊脂上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落；在麥康凱瓊脂上形成圓形、大小均一、直徑約為2.5～3.0 mm、表面光滑濕潤、中央輕微隆起、邊緣整齊的紅色菌落；在營養瓊脂上形成中等大小、圓形微凸起、表面光滑濕潤、邊緣整齊、半透明灰白色菌落，直徑約2～3 mm；在肉湯中培養18～24 h呈現混濁，管底有灰白色黏性沉淀，輕搖試管時沉淀物呈絮狀慢慢升起，部分菌株可在肉湯表面形成菌環；在SS瓊脂上生長較差，呈紅色。

2.2 細菌革蘭氏染色結果

分離的菌種培養物經涂片、革蘭氏染色鏡檢觀察，均可見兩端鈍圓、多數散在排列、不運動、偶爾有2～3個連在一起的革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 生化鑒定結果

對分離到的34株菌分別進行了15項生化試驗，結果菌株對葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘露醇、三糖鐵試驗均產酸產氣，三糖鐵試驗均未產生硫化氫；M-P試驗、吲哚試驗、觸酶試驗、動力試驗呈陽性；枸櫞酸鹽試驗、尿酶試驗、V-P試驗、淀粉試驗呈陰性；不同菌株的蔗糖發酵試驗結果有差異，其余14項生化試驗結果與CVCC1551、CVCC1553一致。結果符合大腸桿菌的生化特征（表1）。

3 討論

從健康雞糞便中分離到34株大腸桿菌，經過分離培養、生化鑒定結果顯示，在伊紅美藍瓊脂上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落；麥康凱瓊脂上為表面光滑濕潤、中央輕微隆起、邊緣整齊菌落；在SS瓊脂上呈紅色，出現了弱利用現象；生化試驗中，34株菌均對葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘露醇、三糖鐵試驗產酸產氣，沒有硫化氫產生；M-P試驗、吲哚試驗、觸酶試驗、動力試驗呈陽性；枸櫞酸鹽試驗、尿酶試驗、V-P試驗、淀粉試驗呈陰性；只有不同菌株的蔗糖試驗結果稍有不同，其原因主要與大腸桿菌的菌型有關，菌型不同利用蔗糖的能力也不同。周倫江等[9]對分離的52株細菌中蔗糖發酵試驗陽性率為59.6%，即31株菌利用蔗糖。陳曉浪等[10]在雞大腸桿菌毒力因子的流行病學及藥物敏感性分析試驗中，在硫化氫試驗中15株菌有2株產生硫化氫；蔗糖試驗中有3株產酸產氣，12株既不產酸也不產氣。王選年等[1]的試驗結果表明，分離的10株菌在蔗糖試驗中有7株產酸產氣，3株既不產酸也不產氣；在甘露醇試驗中9株產酸產氣，1株既不產酸也不產氣。黨巖等[11]在大腸桿菌的分離鑒定試驗中，分離的69株致病性大腸桿菌中35株在蔗糖試驗中產酸。戴建君等[12]在不同來源雞大腸桿菌致病性比較研究試驗中，分離的90株菌的蔗糖試驗結果中陽性率為10%。姜秀鵬等[13]在雞地方性病原大腸桿菌的分離與鑒定試驗中，對16株大腸桿菌進行生化鑒定試驗，其中甘露醇試驗中2株只產酸未產氣，14株產酸產氣；蔗糖試驗中5株只產酸未產氣，2株既不產酸也不產氣，9株產酸產氣。王寶杰等[14]在濰坊地區肉雞致病性大腸桿菌的血清型鑒定試驗中，乳糖試驗陽性率為92%。秦四海[15]在臨沂市雞源致病性大腸桿菌的優勢血清型監測及其致病性試驗中，乳糖試驗陽性率為92.5%；三糖鐵試驗陽性率為97.2%。劉國華等[16]在雞致病性大腸桿菌的分離與血清型鑒定試驗中，乳糖和甘露醇試驗陽性率均為90%。研究表明，大腸桿菌利用蔗糖、甘露醇、乳糖、三糖鐵的能力存在差異，部分大腸桿菌可利用蔗糖，有些大腸桿菌不可利用甘露醇和乳糖，三糖鐵試驗中產生硫化氫，其主要與菌型有關。本試驗中雖然有27株菌在糖發酵試驗中不同程度地利用了蔗糖，但綜合試驗現象，最終確定34株菌均符合大腸桿菌的特性。

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