苞葉雪蓮粗提物對EA.hy926細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用

摘要：通過確定Na2S2O4對EA.hy926細(xì)胞造成缺氧損傷的最佳濃度和時間點建立缺氧損傷模型，以只加Na2S2O4為對照組，添加不同濃度的苞葉雪蓮（Saussurea obvallata）粗提物，從細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞生存率兩個方面檢測其抗缺氧作用，分析苞葉雪蓮粗提物對Na2S2O4造成EA.hy926細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，苞葉雪蓮粗提物從1.25 mg/mL濃度開始呈劑量依賴性的增加了缺氧模型組中EA.hy926細(xì)胞的相對存活率，在10 mg/mL濃度下與Na2S2O4模型組相比，極顯著增加了細(xì)胞存活率，是缺氧模型組的6.3倍，表明苞葉雪蓮具有很強(qiáng)的抗缺氧損傷能力。

關(guān)鍵詞： 苞葉雪蓮（Saussurea obvallata）；EA.hy926細(xì)胞；缺氧損傷

中圖分類號：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0167-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.044

高原環(huán)境因其海拔原因具有氣壓低、氧氣稀薄、空氣干燥、氣候寒冷、紫外線照射強(qiáng)烈等一系列惡劣條件，并隨著海拔的升高這些條件進(jìn)一步惡化，為高原地區(qū)人們的生活、工作及身體健康造成負(fù)面影響。目前，國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，長期暴露在缺氧環(huán)境中會對人的認(rèn)知功能產(chǎn)生一些影響，如感知覺、記憶力、思維力和注意力的下降等，并且對情緒情感和心理運動能力都有負(fù)面反應(yīng)[1]。苞葉雪蓮（Saussurea obvallata）是菊科風(fēng)毛菊屬的植物。分布在印度、錫金、尼泊爾、克什米爾以及中國大陸的云南、甘肅、四川、西藏、青海等地，生長于海拔3 200～4 700 m的地區(qū)，在藏藥中用于治療癲狂、中風(fēng)、腦溢血和偏癱等神經(jīng)性疾病[2]，現(xiàn)在學(xué)者認(rèn)為苞葉雪蓮水提物對小鼠的免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)及整體水平具有輻射防護(hù)作用[3-5]。本試驗通過確定連二硫酸鈉（Na2S2O4）對EA.hy926細(xì)胞造成缺氧損傷的最佳濃度和時間點建立缺氧損傷模型，以只加Na2S2O4為對照組，添加不同濃度的苞葉雪蓮粗提物，從細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞生存率兩個方面檢測其抗缺氧作用，探討苞葉雪蓮粗提物是否具有對Na2S2O4造成EA.hy926細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用，為進(jìn)一步細(xì)分該藥中抗缺氧具體成分奠定基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

EA.hy926細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥材與試劑

苞葉雪蓮粗提物：苞葉雪蓮于2013年8月采自青海省貴德縣，經(jīng)青海省食品藥品檢驗所藏藥室駱桂法研究員鑒定，為菊科風(fēng)毛菊屬苞葉雪蓮全草。將采集的苞葉雪蓮研磨成粗粉經(jīng)90%乙醇熱回流提取，提取液濃縮至流浸膏（相當(dāng)于10 g/mL生藥），使用時用生理鹽水稀釋；連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）、三氯乙酸（TCA），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；培養(yǎng)基（DMEM）、96孔板、培養(yǎng)瓶，Corning公司；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶[0.25% Trypsin-EDTA（1×）]，Gibco公司；二甲基亞砜、磺酰羅丹明B（SRB），Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 復(fù)蘇EA.hy926細(xì)胞，置于37 ℃，5% CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中，用含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化，在細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行試驗。

1.3.2 缺氧模型的建立 將EA.hy926細(xì)胞10 000～20 000/孔接種于96孔板中，檢測Na2S2O4造成細(xì)胞缺氧狀態(tài)的最佳濃度，Na2S2O4可以很快清除緩沖液里的氧，使溶液氧含量為零。Na2S2O4用生理鹽水配制成100 mmol/L母液，參考文獻(xiàn)[6-9]以終濃度8 mmol/L為首濃度，2倍稀釋，共做7個濃度，作用24 h。IncuCyte鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，用SRB法計算不同濃度的Na2S2O4對EA.hy926細(xì)胞的抑制率及半數(shù)抑制濃度IC50。首先，棄去培養(yǎng)基，每孔加100 μL濃度為30%的預(yù)冷TCA，置于4 ℃ 1 h固定細(xì)胞，用去離子水洗滌5次后，晾干，之后每孔加入100 μL濃度為0.04 mg/mL磺酰羅丹明B（SRB，1%冰醋酸配制）染色15 min，染色結(jié)束后用1%冰醋酸洗滌5次，去除未與細(xì)胞結(jié)合的SRB，晾干，最后每孔用10 mmol/L的Tris-base溶液150 μL溶解染料，置于搖床上至染料完全溶解均勻后，用酶標(biāo)儀在560 nm波長下讀取OD560 nm，抑制率=（對照組OD560 nm -給藥組OD560 nm）/對照組OD560 nm×100%。IC50通過四參數(shù)曲線擬合法計算。通過以上結(jié)果選定最佳破壞劑量和時間，拍照記錄，選定模型濃度，用以進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.3.3 細(xì)胞分組及檢測 檢測苞葉雪蓮粗提物對缺氧狀態(tài)下細(xì)胞的保護(hù)作用，將EA.hy926細(xì)胞10 000～20 000/孔接種于96孔板中，細(xì)胞分為三組，陰性對照組、缺氧模型組和加藥組。加藥組加入苞葉雪蓮粗提物，以10 mg/mL為首濃度，2倍稀釋，共8個濃度，粗提物用二甲基亞砜（DMSO）溶解后用生理鹽水稀釋成試驗所需濃度，加藥后確保DMSO終濃度<0.1%，加入96孔板中預(yù)孵育2 h后，加入8 mmol/L的Na2S2O4建立細(xì)胞缺氧模型，作用24 h。IncuCyte鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照記錄。達(dá)到最佳破壞時間后用SRB法檢測細(xì)胞的相對存活率，相對存活率=給藥組或缺氧模型組OD560 nm /陰性對照組OD560 nm×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析結(jié)果，組間差異采用兩樣本均數(shù)比較t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na2S2O4對EA.hy926細(xì)胞存活的抑制結(jié)果

在EA.hy926細(xì)胞中加入不同濃度Na2S2O4作用24 h后，高濃度組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞停止增殖、細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、部分細(xì)胞懸浮未貼壁、黑色代謝產(chǎn)物增加等（圖1）。與對照組相比，細(xì)胞的生存能力劑量依賴性的減弱，說明Na2S2O4對EA.hy926細(xì)胞的增殖具有抑制作用，用SRB法檢測抑制率可以看出，當(dāng)Na2S2O4濃度降到2 mmol/L以下時，對細(xì)胞無明顯的抑制作用（表1，圖1）。根據(jù)不同濃度抑制率做四參數(shù)曲線擬合計算出Na2S2O4的IC50為3.021，表明在3 mmol/L Na2S2O4下抑制了50%細(xì)胞的生存能力，因此在實際過程中選用大于IC50的濃度8 mmol/L進(jìn)行后續(xù)試驗，抑制率為88.81%，可以更大程度地體現(xiàn)出苞葉雪蓮粗提物的保護(hù)作用。

2.2 苞葉雪蓮粗提物對Na2S2O4造成細(xì)胞缺氧的保護(hù)作用

在EA.hy926細(xì)胞上用8 mmol/L Na2S2O4造成缺氧模型之后，加入不同濃度的苞葉雪蓮粗提物，從細(xì)胞存活率和細(xì)胞形態(tài)兩個方面觀察其保護(hù)作用。苞葉雪蓮粗提物10.00 mg/mL濃度下可極顯著增加缺氧細(xì)胞的存活率（P<0.01），與對照組相比的相對存活率是缺氧模型組的6.3倍，說明在該濃度下缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和增殖抑制這些負(fù)面作用被苞葉雪蓮粗提物大部分中和，與缺氧模型組相比具有極顯著差異（表2）。5.00、2.50 mg/mL苞葉雪蓮粗提物可以保護(hù)細(xì)胞，與缺氧模型組相比，相對存活率增加，差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）；當(dāng)苞葉雪蓮粗提物濃度下降到1.25 mg/mL以下時，保護(hù)作用不明顯。

從細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化上觀察，苞葉雪蓮粗提物可劑量依賴性地保護(hù)細(xì)胞，免于缺氧造成的細(xì)胞凋亡、萎縮、增殖抑制，其中10.00 mg/mL濃度下保護(hù)作用最為明顯，細(xì)胞形態(tài)基本完整，懸浮較少，細(xì)胞代謝產(chǎn)物相對減少，細(xì)胞融合率顯著增加。降低濃度后苞葉雪蓮粗提物仍可以保護(hù)細(xì)胞形態(tài)完整，這種保護(hù)作用在0.08 mg/mL濃度下仍可從拍照圖片中觀察出（圖2）。

3 小結(jié)

苞葉雪蓮粗提物從1.25 mg/mL濃度開始呈劑量依賴性地增加了缺氧模型組中EA.hy926細(xì)胞的相對存活率，在10.00 mg/mL濃度下與Na2S2O4模型組相比，極顯著增加了細(xì)胞相對存活率，是缺氧模型組的6倍以上，表明苞葉雪蓮具有很強(qiáng)的抗缺氧損傷能力。這一結(jié)果在動物試驗中已經(jīng)初步得到了驗證，其主要作用成分值得進(jìn)一步分化探討，力求得到抗缺氧有效的單一組分，在臨床應(yīng)用中明確其成分，確定使用劑量和安全性。

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