紅花黃色素聯(lián)合依達拉奉對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制

摘要：目的 研究紅花黃色素（safflor yellow， SY）聯(lián)合依達拉奉（Edaravone， Eda）對心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的保護作用及機制。方法 采用大鼠在體心肌I/R損傷模型，30只雄性SD大鼠按照隨機數(shù)字表隨機分為5組（每組6只）：假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、SY90mg/kg組（SY組）、Eda10mg/kg組（Eda組），SY90mg/kg聯(lián)合Eda10mg/kg組（SY+Eda組）。比色法測血漿超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），我院生化室測肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平，TUNEL染色分析細胞凋亡。結(jié)果 與I/R組相比，SY組、Eda組血漿SOD活性升高，MDA、CK-MB含量及心肌細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；SY+Eda組與SY組、Eda組相比較，血漿SOD活性升高，MDA、CK-MB含量及心肌細胞凋亡減降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 在缺血性心肌損傷中，氧自由基過量生成，心肌細胞大量凋亡，SY、Eda可清除過量生成的氧自由基，降低心肌細胞的凋亡，提示其保護作用與其清除過量生成氧自由基有關(guān)，SY及Eda聯(lián)合用藥可加強對MIRI的保護作用。

關(guān)鍵詞：紅花黃色素；依達拉奉；氧自由基；心肌缺血再灌注

心肌缺血性疾病嚴重危害人類的生命健康，通過介入或藥物溶栓等方法使冠脈再通，是保護缺血心肌的關(guān)鍵，但是由此也可導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷（MIRI），這嚴重影響了其在臨床上的應(yīng)用效果。尋找高效、低毒的治療MIRI的藥物，制定合理的治療方案，成為迫切需要解決的問題。本研究旨在探討紅花黃色素（safflor yellow， SY）聯(lián)合依達拉奉（Edaravone， Eda）對MIRI的保護作用及機制，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器 SY（山西華輝凱德制藥有限公司提供）；Eda（南京先聲制藥有限公司提供）；SOD、MDA及TUNEL試劑盒均購自于南京建成生物科技有限公司；BL-420s生物機能系統(tǒng)、小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；Bio-Tek酶標儀（美國）；LEICA DMIL倒置顯微鏡（德國）。

1.2動物與分組 健康成年雄性SD大鼠（由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供）30只，體重250300g，隨機分為5組（每組6只）：假手術(shù)組（Sham組）、心肌缺血再灌注組（I/R組）、SY90mg/kg組（SY組）、Eda10mg/kg組（Eda組），SY90mg/kg聯(lián)合Eda10mg/kg組（SY+Eda組）。所有試驗均經(jīng)徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物福利和應(yīng)用委員會批準，并遵守國際衛(wèi)生協(xié)會《實驗動物福利和應(yīng)用指南》。

1.3心臟I/R模型的制備和實驗方案 大鼠10%水合氯醛（3.5ml/100g）腹腔注射麻醉后仰臥固定，針式電極固定于大鼠四肢皮下監(jiān)測肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化，腹腔注射肝素鈉（500U/kg）抗凝。行氣管切開，氣管插管，小動物呼吸機輔助呼吸（呼吸頻率75次/min，潮氣量68ml，呼吸比1：2）。暴露心臟，左心耳根部下方2mm處與肺動脈圓錐間穿線，采用套管法，通過牽拉結(jié)扎線結(jié)扎冠脈，以心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯抬高，心肌顏色變暗為結(jié)扎成功的標志，松開動脈夾進行再灌注[1]。Sham組只穿縫線，不結(jié)扎。模型組及藥物干預(yù)各組均進行30min缺血和120min再灌注。再灌注前1min，I/R組、SY組、Eda組、SY+Eda組分別經(jīng)右側(cè)股靜脈輸注生理鹽水、SY90mg/kg、Eda10mg/kg、SY90mg/kg和Eda10mg/kg，SY及Eda均用等量生理鹽水稀釋。Sham組在對應(yīng)時間點股靜脈輸注等量生理鹽水。

1.4觀察指標

1.4.1測血漿SOD、MDA、CK-MB含量 每組取6只大鼠，缺血再灌注末經(jīng)右心室直接穿刺采血，2500r/min離心10min，提取血漿放入-80℃冰箱中，待標本收集完畢后，按試劑盒說明采用比色法測定SOD、MDA，于我院生化檢驗室自動生化儀測定血漿CK-MB活性。

1.4.2組織病理學(xué)觀察 每組取6只大鼠，缺血再灌注末迅速剪取左心室前壁缺血區(qū)心肌組織浸入10%的甲醛溶液中固定2448h，自動脫水機脫水，石蠟包埋、切片。按TUNEL試劑盒說明進行染色，凋亡的細胞核被染成棕褐色，未凋亡的細胞核為深藍色。高倍鏡（×400倍）下每張切片隨機選取10個互不重疊視野計算凋亡率：凋亡率/%=（視野內(nèi)凋亡細胞個數(shù)/視野內(nèi)所有細胞個數(shù)）×100%。

1.4.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SSPS13.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），實驗組之間兩兩比較采用S-N-K法，方差不齊時采用Dunnett’s T3法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1生化指標SOD、MDA和CK-MB變化 與Sham組相比，I/R組及藥物干預(yù)各組MDA、CK-MB含量增高，SOD活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與I/R組相比，SY組、Eda組、SY+Eda組MDA、CK-MB含量降低，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與SY組、Eda組相比，SY+Eda組MDA、CK-MB含量降低，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2心肌細胞凋亡率 與Sham組相比，I/R組及藥物干預(yù)各組心肌細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與I/R組相比，SY組、Eda組、SY+Eda組心肌細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與SY組、Eda組相比，SY+Eda組心肌細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3討論

心肌缺血后再獲取血液供應(yīng)，常會出現(xiàn)細胞代謝功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重的現(xiàn)象[2]，其涉及的機制包括氧自由基（oxygen free radical， OFR）的過量產(chǎn)生、細胞內(nèi)鈣離子超載、多種炎癥介質(zhì)釋放、能量代謝障礙及細胞凋亡等[3]，其中OFR的過量產(chǎn)生是誘導(dǎo)MIRI的重要因素之一[4]。OFR產(chǎn)生過多以及抗氧化酶類活性下降，會引發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷心肌細胞膜、細胞器乃至細胞核酸，導(dǎo)致細胞凋亡和壞死[5]。

研究表明，SY具有抗氧化、改善心肌組織能量代謝、降低細胞內(nèi)鈣離子、減輕細胞凋亡等多種作用，表明SY有對抗MIRI的作用[6，7]。Eda作為特異的OFR清除劑，不僅可以抑制花生四烯酸脂氧合酶途徑，而且對羥自由基（OH）亦有清除作用[8]。

SOD是超氧陰離子（O2-）的清除劑，可直接反映機體清除OFR能力。MDA作為OFR攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用的標志產(chǎn)物，可間接反映機體受OFR攻擊的嚴重程度[9]。

實驗結(jié)果顯示，大鼠發(fā)生MIRI后，OFR過量產(chǎn)生，機體清除OFR能力下降，心肌細胞凋亡增多。給予大鼠SY、Eda靜脈注射后，血漿氧化指標改善，CK-MB活性降低，心肌細胞凋亡減少，且SY聯(lián)合Eda用藥時，增強了OFR清除能力及心肌保護作用，這為指導(dǎo)臨床聯(lián)合用藥提供了依據(jù)。

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