天然植物型抑菌劑的配制及抗菌性能評價(jià)

崔海英 周 慧 張雪婧 趙呈婷 李 偉 林 琳

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

近年來，人們對于綠色安全越來越關(guān)注，對新型植物源或動物源性質(zhì)的殺菌抗菌物質(zhì)的研究也愈加重視［1］。植物型抗菌劑因其毒副作用小而越來越受到喜愛。利用植物提取抗菌材料，并添加到食品或化妝品中，可以在抗菌的同時確保它們的安全性［2］。植物源的天然香辛料，具有香、辛、麻、辣、苦、甜等滋味，它不僅能賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味，還能夠提高和改善食品的風(fēng)味，抑制和矯正食品中不良的氣味，突出食品典型風(fēng)味特征，使食品風(fēng)味協(xié)調(diào)［3］。天然香辛料的殺菌防腐功能很早就已經(jīng)被人發(fā)現(xiàn)并加以利用，因此香辛料越來越受到人們更加廣泛的喜愛。國內(nèi)外對香辛料的研究由來已久，日本［4］曾研究將芥子精油加入塑料制成食品包裝材料，用于替代化學(xué)防腐劑保存食品。江旺等［5］研究了香辛料精油對油料花生氣相防霉的作用。叢健民等［6］研究了香辛料提取物對草莓的保鮮研究。張璟晶［7］研究了天然香辛料的抑菌作用以及對冰鮮銀鯧的保鮮效果。目前對香辛料提取物抗菌性的研究多集中在單個提取物抑菌性的研究，對多種提取物復(fù)配的抑菌性的研究還不多見［8］。本試驗(yàn)擬利用多種具有抗菌性能的天然香辛料植物提取液來配制天然植物型抑菌劑，并對其在草莓上的保鮮作用進(jìn)行研究。此類抑菌劑是由純天然的香辛料植物提取液配制而成，可直接作用于物品、食品甚至人體，可為人們的日常生活中提供自然、健康、無害、有效的抑菌與保鮮制劑［9］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 植物原料

甘草:迷迭香購于奧淼中藥材有限公司;

豆蔻、肉桂、百里香、意大利蠟菊、貫葉連翹:市售。

1.1.2 參試菌種及培養(yǎng)基

大腸桿菌(Escherichia coli IFO 3301)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus 30179)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Enteritidis B11)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia ATCC 13883)、枯草芽孢桿菌(Bacillus cereus IFO 3457):江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院;

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂粉20 g/L;

普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，氯化鈉5 g/L。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋:MLS-3020型，鳥取三洋電機(jī)(廣州)有限公司;

生化培養(yǎng)箱:LRH-250型，上海恒一科技有限公司;

水浴恒溫振蕩器:SHA-B型，江蘇金壇市中大儀器廠;

全溫空氣搖床:QYC-200型，上海福瑪試驗(yàn)設(shè)備有限公司;

高分辨透射電子顯微鏡:JEM-2100(HR)型，日本電子株式會社;

熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡:JSM-7001F型，日本電子株式會社。

1.2 植物提取液的配制

稱取百里香、甘草、肉桂等7種參試香辛料各10 g分別置于容積相同的不同廣口瓶中，分別加入90 mL無水乙醇。將廣口瓶密封后置于水浴恒溫振蕩器中35℃水浴振蕩48 h，過濾、離心、蒸發(fā)得到純植物提取液［10］。貼上標(biāo)簽備用。

1.3 植物提取液最小抑菌濃度的測定

吸取不同濃度的植物提取液于各個無菌平板中，分別與熱的培養(yǎng)基(46～48℃)混合均勻，得到7種含有體積濃度分別為0.1%，0.2%，0.5%的植物提取液的無菌平板。待凝固后在各個平板上用劃線法均勻地在4個不同區(qū)域分別接4種參試菌:大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，鼠傷寒沙門氏菌和副溶血性弧菌。在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h后，根據(jù)培養(yǎng)基上劃線處是否有明顯的細(xì)菌生長的痕跡來判斷各種植物提取液的MIC值。含最低濃度香辛料提取液并且無菌生長者，便為該香辛料對該參試菌的MIC［11］。

1.4 天然植物型抑菌劑的配制

本試驗(yàn)根據(jù)各個香辛料所測得的MIC選擇了除了豆蔻的其余6種具有較好抑菌效果的香辛料提取液進(jìn)行了抑菌劑的配制。配料及配料比參考專利:一種天然植物提取物的混合物及其制備方法和應(yīng)用［12］。分別將體積濃度為0.01%的6種香辛料乙醇提取液，0.1%的檸檬酸，0.05%的檸檬酸鈉，0.005%的EDTA，以及15%的乙醇加入無菌水中，搖勻，貼上標(biāo)簽備用。

1.5 天然植物型抑菌劑對6種致病菌的抗菌性能評價(jià)

在6支空試管里各加入10 mL天然植物型抑菌劑，再分別加入經(jīng)前培養(yǎng)的6種參試菌，使菌液濃度為106CUF/mL和107CFU/mL。另取6支分別加入10 mL磷酸鹽緩沖液［Phosphate-Buffered Saline，PBS，0.03 mol/L，pH(7.2 ～ 7.4)］的試管，同樣加入經(jīng)前培養(yǎng)的上述6種參試菌，作為對照［13］。在恒溫培養(yǎng)搖床中，35℃振蕩培養(yǎng)，同時分別在0，0.5，1，2，4，8，12，24 h 時對各試管中活菌數(shù)進(jìn)行測定。

1.6 天然植物型抑菌劑的機(jī)理分析

分別取經(jīng)天然植物型抑菌劑作用前后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌樣品進(jìn)行透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)和掃描電鏡 (scanning electron microscopy，SEM)樣品制備，分別進(jìn)行電鏡觀察［14，15］。

1.7 天然植物型抑菌劑對草莓的保鮮效果分析

分別將表觀較一致的草莓放入4只保鮮盒中，其中兩盒噴灑配制的天然植物型抑菌劑，另兩盒噴灑無菌水蒸餾水作對照。將1盒對照組草莓和1盒試驗(yàn)組草莓放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中。另外1盒對照組草莓和1盒試驗(yàn)組草莓放入4℃的冰箱中冷藏。每天觀察試驗(yàn)組和對照組的區(qū)別［16，17］。

2 結(jié)果分析

2.1 植物提取液MIC的測定

7種植物提取液對4種參試菌的MIC結(jié)果如表1所示。百里香、迷迭香、甘草、意大利蠟菊、貫葉連翹5種提取液對4種致病菌有明顯的抑菌效果，MIC均為0.5%。肉桂提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為0.2%，有較好的抑菌效果。而豆蔻的植物提取液的MIC均大于0.5%，抑菌作用并不明顯。

表1 7種植物提取液的MICTable 1 The MIC of the seven spices %

2.2 天然植物型抑菌劑對6種致病菌的抗菌性能評價(jià)

由圖1可知，所配制的天然植物型抑菌劑對6種致病菌均有明顯的殺菌作用。但相對而言，對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果更明顯。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，天然植物型抑菌劑對6種致病菌都具有顯著的抑菌效果，其殺菌率達(dá)到99.99%。

圖1 天然植物抑菌劑對6種致病菌的抑菌效果Figure 1 The viable cell counts after the disinfectant treatment

2.3 天然植物型抑菌劑的機(jī)理分析

由圖2、3可知，健康的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)菌形態(tài)完整，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)清晰，單個的細(xì)菌長勢飽滿。但是經(jīng)過天然植物型抑菌劑處理的細(xì)菌其細(xì)胞膜被攻破，細(xì)菌結(jié)構(gòu)散亂，細(xì)胞質(zhì)流出，組織變質(zhì)。從透射電鏡圖和掃描電鏡圖可以看出:天然植物型抑菌劑中的抑菌物質(zhì)可以破壞細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞形態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出，最終導(dǎo)致細(xì)胞完全破裂。

2.4 天然植物型抑菌劑對草莓的保鮮效果

圖2 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在天然植物型抑菌劑作用前后的TEM圖Figure 2 TEM images of S.aureus and E.coli before or after disinfectant treatment

圖3 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在天然植物型抑菌劑作用前后的SEM圖Figure 3 SEM images of S.aureus and E.coli before or after disinfectant treatment

草莓在常溫下保存7 d時，對照組草莓有明顯的菌落出現(xiàn)，并且有汁液流出，草莓有明顯的褐變腐爛現(xiàn)象。而噴灑了天然植物型抑菌劑的試驗(yàn)組草莓的顏色、氣味未發(fā)生大的改變。草莓在常溫下保存10 d時，對照組草莓已經(jīng)嚴(yán)重腐爛，看不出原型，并且有難聞的氣味。而噴灑了天然植物型抑菌劑的試驗(yàn)組草莓并無明顯的菌落產(chǎn)生，也沒有腐爛的跡象，僅有稍微的褐變現(xiàn)象。草莓在4℃冷藏的條件下時，噴灑了抑菌劑的試驗(yàn)組草莓在第10天時才有了一點(diǎn)褐變的現(xiàn)象，但無菌落產(chǎn)生，也沒有發(fā)生腐爛。而對照組草莓第5天就有了菌落的出現(xiàn)和氣味的改變。第10天時，對照組草莓出現(xiàn)明顯的褐變，有難聞的氣味，并且有汁液流出。通過對照可知，所配制的天然植物型抑菌劑能抑制細(xì)菌的生長，起到了防腐保鮮的作用，延長了草莓的保鮮時間。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對豆蔻、肉桂、百里香、意大利蠟菊、貫葉連翹、甘草和迷迭香等7種香辛料進(jìn)行了無水乙醇提取，并對各種香辛料的提取液進(jìn)行了MIC的測定。根據(jù)測定的MIC挑選出了除豆蔻外的6種抗菌性能相對較好的香辛料，以這6種香辛料提取液為原材料根據(jù)配方配制了天然植物型抑菌劑，并對所配制的抑菌劑進(jìn)行了抗菌性能評價(jià)，同時還對天然植物型抑菌劑的機(jī)理進(jìn)行了分析。從試驗(yàn)結(jié)果可知，豆蔻的MIC大于0.5%，肉桂提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為0.2%，對鼠傷寒沙門氏菌和副溶血性弧菌的MIC為0.5%。其余5種香辛料提取液對4種致病菌的MIC均為0.5%。由此可以明顯看到，除了豆蔻外，其余6種香辛料均具有較好的抑菌效果。配制的天然植物型抑菌劑，對6種致病菌均有明顯的抑菌效果，抑菌率可達(dá)到99.99%。從透射電鏡和掃描電鏡圖中可以看出，配制的抑菌劑可以破壞病原菌的細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。最后，在天然植物型抑菌劑對草莓的保鮮試驗(yàn)中，天然植物型抑菌劑能有效地延長草莓的保鮮時間，在第10天，噴灑了天然植物型抑菌劑的草莓才出現(xiàn)了質(zhì)地的變化。本試驗(yàn)證明了以香辛料提取液為原料所配制的抑菌劑有較好抗菌性能，與此同時還能發(fā)揮純天然，安全又綠色的優(yōu)勢，在食品保鮮領(lǐng)域擁有著廣闊的前景。

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